姜黄素诱导骨髓间充质干细胞分化成肝细胞

陈 艳， 邹文静， 王盛丰， 乔洪翔

（1.浙江工业大学药学院， 浙江 杭州 310014； 2.浙江康恩贝制药股份有限公司， 浙江 杭州 310052）

姜黄素诱导骨髓间充质干细胞分化成肝细胞

陈 艳1， 邹文静1， 王盛丰1， 乔洪翔2

（1.浙江工业大学药学院， 浙江 杭州 310014； 2.浙江康恩贝制药股份有限公司， 浙江 杭州 310052）

目的 研究姜黄素诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化为肝细胞的作用。方法 贴壁筛选法体外培养骨髓间充质干细胞, 流式细 胞 仪检测其 表 面抗原。 分组诱导 培 养 14 d:1 组 (空白对照 组),2 组 (10 ng/mL成 纤 维 细 胞生 长 因 子-4,FGF-4),3 组 (10 ng/mL FGF-4+20 ng/mL肝 细胞生长 因 子,HGF),4 组 (10 ng/mL FGF-4+5 μmol/L姜 黄素), 5 组 (20 μmol/L姜黄素) 。 观察细胞形态学改变； 利用 western-blotting分析肝特异性蛋白 HNF-3β的表达。 结果 大鼠骨髓间充质干细胞细胞表面抗原 CD34、 CD14、 CD45 阴性表达,CD44、 CD73、 CD90 表达阳性； 药物诱导后光镜下观察到骨髓间充质干细胞细胞由梭形渐变成圆形肝细胞； 诱导分化后的细胞表达肝特异性蛋白 HNF-3β。 结论 姜黄素具有促进骨髓间充质干细胞分化为肝细胞的作用。

分化；肝细胞；大鼠骨髓间充质干细胞；姜黄素

姜 黄 Curcuma longa L.是 一 种 常 用 的 中 药,具有 活 血、 化 瘀、 行 气、 通 经、 止 痛 等 功 效［1］,而姜黄素 (curcumin) 是从姜黄的根茎中提取的一种二苯基庚烃类成分 (如图 1 所示), 含有量约占姜黄的 3% ～5%［2］。 研 究 证 明［3］, 姜 黄 素 能 有 效促进大鼠骨髓间充质干细胞 (rat bonemesenchymal stem cells,rBMSCs) 早期成骨分化, 且能抑制肝星状细胞 (HSC) 增殖、诱导 HSC凋亡, 使胶原合成减少,减轻肝纤维化大鼠肝内胶原的沉积,从多方面抑制肝纤维化的发生、 发展［4］。 为了进一步了解姜黄素诱导 rBMSCs分化的特点, 本实验以姜黄素为研究对象,以分化为指标,观察其对大鼠间充质干细胞分化为类肝细胞的影响。

图1 姜黄素化学结构Fig.1 Chem ical structure of curcum in

1 材料

1.1 药物 与 试 剂 胎 牛 血 清 (Hyclone),DMEM高、 低 糖 培 养 基 (Gibco)； PerPC 标 记 抗 大 鼠CD14、 CD44、 CD34、 CD90、 CD73、 CD45(Santa Cruz)； PE标 记 抗 小 鼠 IgG(Katara) ； PerPC标 记抗小 鼠 IgG(Santa Cruz)； FITC标 记 抗 小 鼠 IgG (Santa Cruz)； 胰 岛 素 ( 江 苏 万 邦 生 化 医 药 股 份 有限)； 转化 生 长 因 子 β1(RB)； ITS+(Sigma)；地 塞 米 松 (Sigma)； FGF-4(peprotech)； HGF (peprotech)； 山 羊 抗 大 鼠 HNF-3β 一 抗 (Santa cruz)； 兔抗山羊 IgG二抗 (Santa cruz)； 兔抗大鼠β-actin 一抗 (Santa cruz)；羊抗兔 IgG二抗 (博士德)姜黄素标准品购自中国药品生物制品检定所,编号 07372200173。

1.2 仪 器 流 式 细 胞 仪 (BD Biosciences) ；CO2细胞 培 养 箱 (Galaxy)；Nikon 光 学 倒 置 显 微 镜(Nikon)； 电 泳 仪 (Tanon)； 日 立 高 速 离 心 机CR21G(日立工机株式会社)； 紫外分光光度计UV2550(日本岛津株式会社)。

1.3 动物 4 ～6 周龄雄性清洁级 SD大鼠 3 只,体质量 100 ～120 g, 购于浙江省医学科学院, 许可证 SCXK(浙)2008-0233。

2 实验方法

2.1 rBMSCs的分离与培养 脱颈法处死大鼠,取出股骨和胫骨置装有 D-Hanks液的烧杯中； 用含血清培养基反复冲洗骨髓腔,收集骨髓细胞悬液, 200 目 筛 网过滤,1 500 r/min 离 心 3 min 后 混 悬 细胞, 接种到培养皿中, 置于 CO2培养箱中培养；接种后第 24 小时和第 48 小 时全量 换液, 后每 3 d全量换液一次, 至细胞 70% ～80%融合时, 进行传代培养。

2.2 流式细胞术检查 rBMSCs表面抗原 将生长状态良好的第三代细胞按 1 ×105个/管的密度平均分到 1.5 mL离心管 中,1 000 r/min 离 心 5 min 后,弃去上清, 加入 D-Hanks液 100 μL重悬细胞； 分别向 各 管 细 胞 中 加 入 PerPC标 记 抗 大 鼠 CD14、FITC标记 抗 大 鼠 CD34、 FITC标 记 抗 大 鼠 CD44、PE标记抗大鼠 CD90、PE标记抗大鼠 CD73、 PE标记抗大鼠 CD45、 FITC标记抗小鼠 IgG、 PE标记抗小鼠 IgG、 PerPC标记抗小鼠 IgG, 以及 D-Hanks液 (阴性对 照管), 常温 避 光 45 min, 用 D-Hanks液洗细胞3次后,进行流式细胞术检测,以判断rBMSCs的均一度。

2.3 姜黄素诱导 rBMSCs分化为肝细胞的实验

将生长状态良好的第三代细胞细胞悬液以 2 ×104细胞/mL接种于 6 孔板中； 待细胞完全融合生长时,弃去培养基,分成5组进行诱导分化,1组(空白对照组): 仅更换 DMEM低糖培养基； 2 组(单细胞 因 子 组):10 ng/mL FGF-4 诱 导 48 h 后,更换 DMEM低糖培养基；3 组 (联合诱导组): 10 ng/mL FGF-4+5 μmol/L姜 黄 素 诱 导 48 h 后,更换 DMEM低糖培养基； 4 组 (双细胞因子组): 10 ng/mL FGF-4+20 ng/mL HGF诱 导 48 h 后, 更换 DMEM 低 糖 培 养 基； 5 组 (姜 黄 素 组) 20 μmol/L姜黄素 诱 导 48 h 后, 更换 DMEM低糖培养基； 每3 d换液 一 次, 诱导14 d后 对 分化细胞进行鉴定。

2.4 细胞形态学观察 每日于倒置显微镜下观察细胞分化前后的形态学改变。

2.5 Western blotting法测定肝特异性蛋白 HNF-3β的表达 细胞诱导14 d后, 将蛋白裂解液加入收集到的细胞中； 每隔 5min 剧烈震荡1min, 重复6 次,再将样品 4 ℃ 12 000 r/min 离 心 30 min。 吸取 上 清细胞蛋白溶液, 采用 Coomassie Brilliant Blue法 进 行蛋白定量,将所有蛋白样品调至等浓度,充分混合后加 loading buffer后 上 样。 将 蛋 白 样 品 在 15% 的SDS-PAGE凝胶中电泳约 3 h, 然后转印至 PVDF膜上,5%脱脂 奶 粉 封 闭 2 h 后, 加 入 HNF-3β一 抗(1 ∶1 000) 过夜。 TTBS 洗 3 次后加入辣根过氧化物酶标记的二抗 (1 ∶1 000) 作用30 min,ECL法显色、X光胶片显影定影后分析处理。

3 结果

3.1 流式细胞仪检测结果 流式结果显示, 分离培养 得 到 的 细 胞 能 高 表 达 rBMSCs的 表 面 抗 原CD44、 CD73 以及 CD90, 但不能够表达造血系细胞的表面抗原 CD14、 CD34 以及 CD45, 表明我们分离培养获得较为均一的 rBMSCs。 具体流式结果见图2所示。

图 2 rBMSCs表面抗原表达情况Fig.2 Analysis phenotype of the rBMSCs by flow cytometry

3.2 分化的细胞形态学的改变 每日光镜观察显示, 细胞自分化后第 3 天起, 梭形的 rBMSCs形态逐渐发生改变,有向圆形细胞变化的趋势；到第14天前后, 大部分细胞呈类似肝细胞样的圆形,而空白对照组的细胞形态无改变。如图3所示。

3.3 Western-blotting检测细胞内 HNF-3β蛋白表达水平 从 western blotting图可以看出, 在诱导的第14天, 单细胞因子、 双因子以及姜黄素组都可以直接诱导 rBMSCs分化为肝细胞, 姜黄素联合FGF-4 组 HNF-3β的表达量高于单细胞因子 FGF-4组； 而 20 μmol/L的姜黄素组对 rBMSCs具有单独诱导分化的作用。如图4所示。

图 3 rBM SCs分 化成肝细 胞 的形态学 变 化Fig.3 M orphology of MSCs at different culture times

图 4 分化的细胞表达肝特异性蛋白 （HNF-3β）Fig.4 Protein expression of HNF-3βin MSCs after differentiation

4 讨论

肝纤维化是多种慢性肝病的终末期病理表现［5］, 目前临床 对 其 治 疗 多 采 用 综 合 疗 法, 但 并未从根本上改变该病的预后。近年来有不少文献报道［6］, 骨髓 间 充 质干 细 胞 (BMSCs) 可 以 分化 为肝细胞,改善肝功能,从而为终末期肝脏疾病患者带来希望。 与此同时, 中医药在 BMSCs增殖分化影响上的研究亦 有 不 少 突 破［7］。本 实 验 通过 观 察姜黄素联合细胞生长因子 FGF-4 对 rBMSCs的肝向细胞诱导分化的作用效果,为从中药中寻找适宜的诱导分化剂提供思路。

从临床应用角度来讲, 向培养的 BMSCs中加入相应的诱导因子 (如 FGF-4、bFGF、 血管内皮生长因子等)或者化学药物是最有前途的体外诱导方案［8］。 FGF-4 是 一 种 内 胚 层 的 形 态 诱 导 发 生素, 在内 胚 层 的 起 源 和 分 化 中 发 挥 重 要 作 用［9］。然而,FGF-4 虽能启动 MSCs向肝细胞的分化, 但由于其不是有效的分化剂,使得最后的分化效率非常低。 因此, 必须寻找能协同 FGF-4 进行有效分化的物质。肝细胞生长因子 (HGF) 是目前国际上采用细胞诱导分化的方法中都涉及到的关键因子, 其可以单独诱导 BMSCs分化为肝 细胞［10］； 也可以联合 FGF-4, 以提高分化的 效率［11］。 鉴于此,本研究中将 FGF-4+HGF作为阳性对照组, 单独FGF-4 诱导组为阴性组。 但是,HGF因其存在促进肿瘤细胞的生长,侵袭及转移等效应,故存在很多不确 定 性 和 潜 在 的 危 险 性［12-13］。 因 此, 本 研 究 的目的即要从中药中找到一种无毒的诱导分化剂来代替 HGF。 实验结果证明, 采用联合生长因子 FGF-4及低剂量的姜黄素 (5 μmol/L) 的诱导模式成功的将 rBMSCs诱 导 分 化 为 肝 细 胞,Western blotting法检测发现, 诱导后细胞肝脏蛋白 HNF-3β特异表达,HNF3β的表达在肝脏的发育和肝干细胞的分化中 具 有 重 要 作 用［14-15］。 在 此 基 础 上, 实 验 进 一步考察了姜黄素单独诱导 rBMSCs的肝向分化作用。 结果显示姜黄素在 20 μmol/L具有单独诱导rBMSCs分化为肝细胞的作用, 而在 20 μmol/L以上则不具有更强的诱导能力,且具有潜在的毒性。

综上所述,20 μmol/L姜黄素能单独诱导 rBMSCs分化为肝细胞, 与 FGF-4 联合应用可使姜黄素的诱导浓度降低,不仅效果更好,且安全性更可靠。

参考文献:

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Curcum in induces the differentiation of bone m arrow m esenchym al stem cells into hepatocytes

CHEN Yan1, ZOUWen-jin1, WANG Shen-feng1, QIAO Hong-xiang2

(1.College of Pharmaceutical Science,Zhejiang University of Technology,Hangzhou 310014,China； 2.Zhejiang Conba Pharmaceutical Co.,Ltd., Hangzhou 310052,China)

AIM To investigate whether curcumin can induce differentiation of rat bone mesenchymal stem cells(rBMSCs)into hepatocytes in vitro.MWTHODS rBMSCswere isolated from adult SD rats,and then were cultured and cloned by density gradientmethod and adhesive cultivation.Their cell surface antigens were detected with flow cytometer.rBMSCs obtained were randomly assigned to five groups:group 1(control),group 2(induced by 10 ng/mL FGF-4),group 3(induced by 10 ng/mL FGF-4 combined with 5 μmol/L curcumin),group 4(induced by 10 ng/mL FGF-4 combined with 20 ng/mL HGF),and group 5(induced by 20 μmol/L curcumin).After induction,hepatocytes cell percentage was determined,and the expression of specific proteins of HNF-3βwas analyzed.RESULTS CD44,CD73 and CD90 expression of rBMSCs was positive while that of CD34,CD14 and CD45 was negative,indicating the successful culture of rBMSCs.After induction with curcumin,rBMSCs showedmorphological variation.The expression levels of HNF-3 βin group 2,3,and 4 were significantly higher than those in the group 1.CONCLUSION Curcumin can induce rBMSCs to differentiate into hepatocytes cells in vitro.

differentiation； hepatocytes； rBMSCs；curcumin

R285.5

:A

:1001-1528(2014)06-1124-05

10.3969/j.issn.1001-1528.2014.06.003

2013-04-12

浙江省自然科学基金资助 (Y2111178)； 浙江省科技厅重大专项基金资助 (2010C13015)

陈 艳 (1977—), 女, 博士, 副教授, 研究方向: 中药药理。 Tel:15888851620,E-mail:chenyan2008@zjut.edu.cn