浙江台州地区老年2型糖尿病患者TNF-α基因多态性检测与分析

饶高峰 沈屹 吴金友 陈恩富 曾爱平

浙江台州地区老年2型糖尿病患者TNF-α基因多态性检测与分析

饶高峰 沈屹 吴金友 陈恩富 曾爱平

目的 研究TNF-α基因多态性在浙江台州地区2型糖尿病患者中的分布与相关性。方法利用DNA测序法对100例老年2型糖尿病患者（观察组）及50例健康体检者（对照组）的TNF-α基因-308位点和-238位点进行基因检测与分析。结果观察组FPG、TNF-α、TG、TC、胰岛素抵抗指数（IRI）分别为（10．68±2．75）mmol/L、（2．01±0．25）ug/L、（2．43±1．15）mmol/L、（5．49±1．63）mmol/L及4．65±0．97，均高于对照组，差异均有统计学意义（均P＜0．05），HDL为（1．23±0．28）mmol/L，低于对照组，差异有统计学意义（P＜0．05）。而BMI、LDL[（25．34±2．41）kg/m2、（3．26±1．3）mmol/L]与对照组比较，差异无统计学意义（P＞0．05）。TNF-α基因-308位点在观察组和对照组GA+AA基因频率分别为31%和10%，A等位基因频率分别为16%和5%，差异有统计学意义（P＜0．05）。而-238位点未见突变，两组间比较无明显差异。结论TNF-α基因G-308A单核苷酸多态性与2型糖尿病存在相关性。

老年人2型糖尿病 肿瘤坏死因子 单核苷酸多态性

糖尿病是严重影响人类健康的疾病之一。研究表明2型糖尿病是一种免疫性疾病，是细胞因子介导的炎症反应，炎症在其发病机制中起媒介作用。近年来对肿瘤坏死因子α（TNF-α）的研究发现，TNF-α基因多态性与糖尿病的发生有关[1-2]，但其与老年糖尿病患者的发病是否相关，目前尚不清楚。TNF-α基因存在多个多态性位点，基因多态性影响TNF-α基因产物的表达，进而可能影响老年人对于糖尿病的易感性及患病的严重程度。近来TNF-α基因启动区第308位（-308）和Y盒第238位（-238）的单核苷酸多态性（SNP）成为研究热点[3]。本研究分析2型糖尿病患者及健康体检者的TNF-α基因-308位点（-308）和-238位点（-238）进行基因多态性，探讨TNF-α基因-308及-238的SNP位点与老年2型糖尿病发病的相关性。

1 对象和方法

1.1 对象 选择2011-06—2013-06我院内分泌科住院及门诊老年2型糖尿病患者100例（观察组），其中男55例，女45例，年龄60～85（68.51±4.63）岁；诊断符合1997年ADA老年糖尿病诊断标准。所有患者均为初诊，未经任何降糖药物等治疗，无严重心、肝、肾疾病、糖尿病慢性并发症及其它内分泌系统疾病。选择同期健康体检者50例作为对照组，其中男28例，女22例，年龄60～82（66.71±5.32）岁。所有研究对象均为浙江台州地区人群，且无血缘关系。两组性别、年龄差异均无统计学意义（均P＞0.05）。

1.2 方法

1.2.1 代谢指标检测 受试者空腹8～10h后抽取肘静脉血2ml，采用EDTA抗凝，置于-20℃冰箱中备抽取DNA和检测TNF-α的基因；非抗凝血5ml凝固后离心分离血清。直接送检FPG、TG、TC、HDL-C、LDL-C、空腹血浆胰岛素等指标。采用Beckman全自动生化分析仪检测上述指标。采用放射免疫检测两组TNF-α和空腹血浆胰岛素水平。胰岛素抵抗指数（IRI）计算采用公式：IRI=空腹血糖×空腹血浆胰岛素/22.5。

1.2.2 基因型检测 （1）样本基因组DNA提取：取EDTA抗凝血2ml，用饱和氯化钠法提取。PCR扩增目的片断：引物序列（宝生物工程公司合成）为上游：5′-CCCCTCCCAGTTCTAGTTCTATC-3′，下游：5′-GAATCATTCAACCAGCGGAAA-3′。（2）PCR反应体系：20μl反应体系中含有1×PCR缓冲液，200μmol/L dNTP，上下游引物各0.1μmol/L，基因组DNA 100ng，Taq酶2U。（3）反应条件：94℃预变性5min；40个循环：94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s；最后72℃延伸5min。（4）PCR产物测序：扩增产物按照宝生物PCR产物回收试剂盒说明书的操作步骤进行回收纯化，纯化产物由宝生物工程公司测序。

1.3 统计学处理 采用SPSS 11.5统计软件，计量资料以表示，比较采用t检验，计数资料组间比较采用χ2检验。

2 结果

2.1 观察组及对照组代谢指标比较 见表1。

表1 观察组及对照组代谢指标比较

由表1可见，观察组TG、TC、TNF-α、IRI均高于对照组，FPG显著高于对照组，HDL-C低于对照组，差异均有统计学意义（P＜0.05或0.01）。两组BMI和LDL-C比较差异无统计学意义（P＞0.05）。

2.2 患者DNA样本PCR产物测序结果 见图1。

由图1可见，TNF-α基因-238位点测序结果全部为野生型GG（图1A），未见点突变。而-308位点有3种基因型GG、GA和AA，其中GA为杂合型。

2.3 观察组和对照组TNF-α基因型、等位基因的分布和频率比较 见表2。

表2 TNF-α基因型、等位基因的分布和频率比较[例（%）]

由表2可见，观察组GA基因型频率为28%，AA基因型频率为3%，A等位基因频率为16%，因此可知观察组GA+AA基因型频率为31%，观察组A等位基因频率高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。

3 讨论

目前大多数学者认为，2型糖尿病是一种多基因疾病，但病因和发病机制尚无定论。探索2型糖尿病的病因及针对病因的治疗预防措施是国内外研究的重要课题。2型糖尿病是胰岛素抵抗（IR）和胰岛功能障碍相互作用的结果，IR不仅是2型糖尿病发生和发展的重要因素，也是引起一系列代谢异常如血脂异常的核心。TNF-α是一种具有多种生物学功能的细胞因子，近年在一些动物模型中发现TNF-α可过度表达，通过抑制外周组织葡萄糖摄取、抑制胰岛素受体及其底物磷酸化导致IR的发生[4]。IR是2型糖尿病的重要致病因素之一。鉴于TNF-α基因的生物学活性及其基因多态性特点，TNF-α基因可能是2型糖尿病的候选基因之一。

本研究结果发现，在临床代谢指标方面，观察组TC、TG、TNF-α、IRI均高于对照组，而HDL低于对照组，差异有统计学意义。国内外对TNF-α基因多态性与IR或其相关代谢紊乱进行了大量研究。基因多态性影响其产物的表达，不同的基因型可以产生不同的蛋白，从而影响疾病的易感性及严重性。TNF-α基因存在多个基因多态性位点，其一是位于基因启动子区第308位由A取代G，未突变时可被限制性内切酶NcoⅠ酶切，存在GG（无突变）、GA（突变杂合子）和AA（突变纯合子）3种基因型[5]。TNF-α基因多态性与2型糖尿病的关系目前国内外研究结论不一致。Fernadez-Real等[6]报道TNF-α第308位A等位基因携带者胰岛素敏感指数明显下降，认为TNF-α基因多态性与IR有一定相关性。Wilson等[7]报道，与TNF-α野生型的基因型相比，突变的基因型使Raji细胞中的TNF-α的转录效率增加6～7倍，而转录效率是TNF-α表达的重要调节因素，TNF-α基因调节的变异导致脂肪细胞中TNF-α表达增加。Shao等[8]对440例中国香港地区的居民（其中240例2型糖尿病患者）TNF-α启动子-308G/A基因多态性与糖尿病的关系进行研究后认为，TNF-α启动子-308G/A基因多态性与糖尿病的发生无关。

图1 患者DNA样本PCR产物测序结果[A：-238位点测序结果（基因型GG）；B：-308位点测序结果（基因型GG）；C：-308位点测序结果（基因型GA）]

本研究表明浙江台州地区老年2型糖尿病患者GA+AA基因型频率为31%，A等位基因频率为16%，均高于对照组，差异有统计学意义。TNF-α基因-308位点在观察组中变异的GA基因型频率为28.0%，与对照组比较差异有统计学意义；而-238位点在两组之间差异无统计学意义。观察组和对照组的TNF-α差异有统计学意义，进一步研究可知TNF-α基因型与其存在正相关。TNF-α第308位GA变异可能通过使TNF-α水平增高而增加IR和血脂代谢异常，从而参与2型糖尿病的发生、发展，这种结果与Wilson等[5]的研究一致。说明TNF-α基因-308位点G/A单核苷酸多态性与老年2型糖尿病的发生有相关性。不过，2型糖尿病是一个多基因遗传的疾病，虽然TNF-α基因-308位点的多态性可能通过影响TNF-α表达与IR有一定的关联，但在2型糖尿病的发生发展中不一定起到决定性作用。

[1]Uysal K T,Wiesbrock S M,MarinoM W,et al．Protection from obesity-induced insulin resistance in mice lacking TNF-α function [J]．Nature,1997,389(2)：610-614．

[2]Chaim O J,Sndarazn A,Sara Mi．Preventions of diabetes in nonobese diabetic mice by TNF,similarities between TNF-γ and IL-1 [J]．Proc Natl Acad Sci USA,1990,87(3)：968-970．

[3]Kim H R,Lee M K,Park A J．[The-308 and-238 Polymorphisms of the TNF-alpha Promoter Gene in Type 2 Diabetes Mellitus[J]．Korean J Labed,2006,26(1)：58-63．

[4]LLfgren P,van Harmelen V,Reynisdottir S,et al．Secretion of tumor necrosis factor-alpha shows a strong relationship to insulin-stimulated glucose transport in human adipose tissue[J]．Diabetes,2000,49(5)：688-692．

[5] Wilson A G,de Vries N,Pociot F,et al．An Allelic polymorphism within the human tumor necrosis factor alpha promoter region is strongly associated with HLA A1,B8 and DR3 alleles[J]．J Exp Med,1993,177(2)：557-560．

[6]Fernandez-Real J M,Gutierrez C,Ricart W,et al．The TNF-αgene Nco I polymorphism influences the relationship among insulin resistance,percent body fat,and increased serum leptin levels[J]．Diabetes,1997,46(9)：1468-1472．

[7]Wilson A G,Symons J A,Mcdowell T L,et al．Effects of a polymerphism in the human tumor necrosis factor alpha promoter on transcriptional activation[J]．Proc Natl Acad Sci USA,1997,94(5)：3195-3199．

[8] Shao C,Yong P U．Tumor necrosis factor alpha gene G-308A polymorphism in the metabolic syndrome[J]．Metabolism,2000, 49(10)：1021-1024．

TNF-α G308A and G238A polymorphism in patients with type 2 diabetes mellitus in Taizhou region

Objective To investigate the polymorphism of TNF-α gene in patients with type 2 diabetes mellitus(T2DM)in Taizhou region of Zhejiang province．MethodsBlood specimens were collected from 100 elderly patients with type 2 diabetes mellitus and 50 normal elderly subjects from Taizhou region of Zhejiang Province．Genomic DNA was extracted from blood samples．The primers of PCR for the SNPs of G308A and G238A were optimized and the polymorphism of amplicons was analyzed by DNA sequencing．ResultsFPG,TNF-α,TG,TC and insulin resistance index in T2DM group were 10．68±2．75mmol/L,2．01± 0．25μg/L,2．43±1．15mmol/L,5．49±1．63mmol/L and 4．65±0．97,respectively,which were all higher than those in control group (P＜0．05)．The HDL-C(1．23±0．28mmol/L)was lower than that in controls(P＜0．05),while there was no difference in BMI(25．34± 2．41kg/m2)and LDL(3．26±1．3mmol/L)between T2DM patients and controls(P＞0．05)．The frequency of GA+AA genotype in TNF-α-308 gene of T2DM group and control group was 31%and 10%，and A allele 16%and 5%,respectively(P＜0．05);while there was no difference in genotype and A allele frequency in TNF-a-238 gene between two groups．ConclusionThe 308 G-A polymorphism of TNF-α promoter gene may be associated with type 2 diabetes mellitus in elderly patients from Taizhou region of Zhejiang province．

Type 2 diabetes mellitus in elderly patients Tumor necrosis factor-α SNP

2013-09-11）

（本文编辑：杨丽）

浙江省台州市科技计划项目（072KY46）

317500 温岭市第一人民医院内分泌科（饶高峰、吴金友、陈恩富、曾爱平）；浙江省台州医院路桥院区内分泌科（沈屹）