mTOR-PKM2信号通路与宫颈鳞癌新辅助动脉化疗疗效的相关性研究

吴均 陈苗苗 王颖 段萍 朱雪琼

●论 著

mTOR-PKM2信号通路与宫颈鳞癌新辅助动脉化疗疗效的相关性研究

吴均 陈苗苗 王颖 段萍 朱雪琼

目的 研究雷帕霉素靶蛋白（mTOR）-丙酮酸激酶M2（PKM2）信号通路在宫颈鳞癌新辅助动脉化疗前后的改变及其与化疗敏感性的相关性，以期在化疗前预测宫颈鳞癌对化疗药物的敏感性，使患者得到更加有效的个体化治疗。方法选取2007—2012年因巨块型Ⅰb～Ⅱa期宫颈鳞癌行新辅助动脉化疗和宫颈癌根治术的患者36例，所有患者术前均接受以顺铂为基础的联合化疗，评估化疗的疗效。（1）采用Western blot法，检测宫颈鳞癌组织中mTOR和PKM2蛋白的表达。（2）采用免疫组化SP法，检测化疗前后、化疗有效组和无效组宫颈鳞癌组织中mTOR和PKM2的表达差异。结果（1）化疗1～2个周期后，36例宫颈鳞癌患者中，19例为化疗有效，17例为化疗无效。（2）mTOR和PKM2蛋白在宫颈鳞癌组织中特异性表达。（3）mTOR和PKM2蛋白在化疗后宫颈鳞癌组织中的表达均明显低于化疗前（均P＜0．05）。（4）化疗前宫颈癌组织中mTOR和PKM2蛋白的表达在化疗有效组中均比化疗无效组中高（均P＜0．05）。结论早期巨块型宫颈鳞癌组织中mTOR和PKM2蛋白的表达与新辅助动脉化疗的疗效相关。化疗前宫颈鳞癌组织中mTOR和PKM2蛋白的表达有可能成为宫颈癌新辅助动脉化疗疗效的预测指标。

雷帕霉素靶蛋白 丙酮酸激酶M2 宫颈肿瘤 化疗 新辅助

近年来，新辅助化疗被广泛用于治疗局部晚期宫颈癌，尤其是巨块型Ⅰb和Ⅱa期的宫颈鳞癌患者[1]。新辅助化疗可以缩小肿瘤体积，减少淋巴结转移，降低肿瘤的分期，提高随后的手术切除率和放射治疗的敏感性[2]。但并非每例患者都对化疗药物敏感，因此，在新辅助化疗前预测宫颈癌对化疗药物的疗效，以实现“预见性”的新辅助化疗有着很重要的临床意义。但是，目前尚无明确的预测新辅助动脉化疗有效性的指标。

糖酵解关键酶丙酮酸激酶M2（pyruvate kinase type M2，PKM2）是雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）信号通路下游的一个主要效应因子。大量研究表明，mTOR/PKM2信号级联参与有氧糖酵解，与多种恶性肿瘤的发生、发展、转移、预后等相关[3-4]。同时，mTOR、PKM2与恶性肿瘤的化疗敏感或耐药相关[5-7]。我们的前期工作发现宫颈鳞癌组织中PKM2的表达在化疗后的表达明显改变[8]，提示PKM2可能与宫颈癌新辅助动脉化疗的疗效相关。本研究采用免疫组化染色的方法，观察宫颈鳞癌患者新辅助动脉化疗前后宫颈癌组织中PKM2和mTOR蛋白的表达变化，寻找宫颈癌新辅助动脉化疗疗效相关的蛋白，以期在化疗前预测肿瘤对化疗药物的敏感性，使患者得到更加有效的个体化治疗。

1 对象和方法

1.1 对象 2007-01—2012-08在我院就诊并因巨块型（肿瘤直径＞4cm）Ⅰb～Ⅱa期宫颈鳞癌行新辅助动脉化疗和宫颈癌根治术的患者36例，术前未接受任何治疗。患者年龄25～62岁，中位年龄44岁。根据FIGO 2009年宫颈癌临床分期，其中Ⅰb2期21例（58.3%），Ⅱa2期15例（41.7%）。本研究经本院伦理委员会批准。接受新辅助动脉化疗的患者均签署知情同意书。

1.2 纳入标准 （1）活检病理报告为宫颈鳞状细胞癌；（2）治疗前由2位妇科主任医生三合诊均诊为Ⅰb或者Ⅱa期的宫颈鳞癌；（3）盆腔MRI检查宫颈病灶直径＞4cm；（4）骨髓造血功能无明显受损：血白细胞数＞4.0×109/L，Hb＞80g/L，Plt＞100×109/L；（5）无明显内科合并症，肝肾功能和心电图正常；（6）Karnofsky评分≥80分；（7）患者依从性好，治疗前均知情同意。

1.3 治疗方法和疗效判定 采用Seldinger技术，行双侧子宫动脉插管灌注化疗加栓塞。化疗方案是以顺铂为主的联合化疗：顺铂50mg/m2+5-氟尿嘧啶500mg/m2+丝裂霉素8mg/m2，单次灌注。根据化疗疗效分别给予1～2个疗程的化疗。所有患者均在化疗结束后14～22d行广泛全子宫切除加盆腔和（或）腹主动脉旁淋巴结清扫术。

1.4 化疗疗效判定 患者接受化疗前通过妇科检查及影像学检查测量病灶大小，动脉化疗结束后2周时根据WHO实体瘤的近期疗效评定标准评估化疗疗效[9]，采用阴道B超和（或）MRI测量病灶的最大直径及其最大垂直横径，用两者的乘积来评估局部癌灶的变化。完全缓解：指肿瘤完全消失，部分缓解：指肿瘤缩小50%以上；稳定：指肿瘤缩小不足50%或增大不超过25%；进展：指肿瘤增大超过25%或有新病灶出现。化疗后宫颈局部癌灶完全缓解或部分缓解为化疗有效组，化疗后局部癌灶稳定或进展为化疗无效组[8]。

1.5 标本收集及处理 在化疗前和手术中获得局部宫颈癌组织标本。10%甲醛溶液固定，常规脱水、透明，石蜡包埋，制成蜡块，切片。每例病例均经HE常规染色，由经验丰富的病理科医生确诊为宫颈鳞癌。

1.6 试剂和仪器 兔抗人多克隆抗体PKM2购自美国CST公司。兔抗人多克隆抗体mTOR购自英国的Abcam公司。增强化学发光试剂（ECL）购自美国Pierce公司。鼠抗人单克隆抗体GAPDH、辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG、辣根过氧化物酶标记山羊抗鼠IgG、RIPA蛋白裂解液购自上海碧云天生物技术有限公司。SP-9000过氧化物酶标记的链霉卵白素染色试剂盒、DAB显色试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司。GS-800扫描仪购自美国Bio-Rad公司。

1.7 免疫印迹（Western blot）方法 RIPA蛋白裂解液提取蛋白，BCA法测定蛋白浓度，取50μg蛋白质于8%十二烷基磺酸钠（SDS）聚丙烯酰胺凝胶中电泳分离蛋白，先70V电泳40min，然后120V电泳50min，湿转法将蛋白转到聚偏氟乙烯膜上，用300mA恒流转移目的蛋白（PKM2转移60min，mTOR转移120min）。用含5%脱脂奶粉和Tween-20的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲液于室温中振荡封闭2h。分别加入相应一抗（兔抗人PKM2、mTOR，稀释度均为1∶1 000；鼠抗人GAPDH抗体，稀释度1∶500）。4℃摇床过夜后，分别加入相应二抗（用辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔和山羊抗鼠，稀释度1∶1 000）；ECL化学发光溶液中反应，显影、定影。胶片由GS-800扫描仪扫描。

1.8 免疫组化方法和结果判定 使用免疫组化SP法。切片脱蜡入水，浸入0.01mol/L枸橼酸盐（pH 6.0）中行微波修复，先中高火5min，停5min后再中高火5min，3%H2O2阻断过氧化物酶活性20min，山羊血清室温孵育30min。然后滴加相应一抗（兔抗人多克隆抗体PKM2、mTOR，均为1∶100稀释），4℃过夜。生物素标记二抗室温孵育30min，后滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液，室温孵育15min，DAB显色，显微镜观察，水洗终止，苏木素复染，淡氨水返蓝，树脂封片，光镜下观察。每一批染色均设阴性和阳性对照。以PBS代替一抗作阴性对照，PKM2用已知有阳性表达的肺癌切片作为阳性对照，mTOR用已知有阳性表达的前列腺癌切片作为阳性对照。PKM2和mTOR阳性染色表现为细胞质和（或）细胞核呈棕黄色。每张切片观察10个随机400倍视野，每个视野观察100个细胞，根据免疫组化评分标准分别进行阳性率及着色强度评分。阳性率评分：＜5%为0分，6%～24%为1分，25%～49%为2分，50%～74%为3分，＞75%为4分；着色强度：无着色为0分，浅黄色为1分，浅棕色为2分，深棕色为3分；将阳性百分率和着色强度两项评分的乘积进行统计分析。

1.9 统计学处理 采用SPSS 19.0统计软件，计量资料对数据先进行正态性检验，非正态分布数据用中位数（P25～P75）表示其分布特征。宫颈癌化疗前、后组织中表达的差异采用配对秩和检验。化疗前宫颈癌中的两种蛋白质在化疗有效组与化疗无效组之间的表达差异采用Mann-Whitney U法。

2 结果

2.1 宫颈中分化鳞癌组织中PKM2和mTOR蛋白的特异表达 见图1。

图1 宫颈中分化鳞癌组织中PKM2和mTOR蛋白的特异表达（Pre：化疗前组织；Post：化疗后组织）

2.2 mTOR和PKM2蛋白在化疗前后宫颈癌组织中的表达差异 见表1、图2-3。

表1 PKM2和mTOR在化疗前后宫颈癌组织中的表达情况［中位数（P25～P75）］

由表1可见，PKM2和mTOR蛋白在化疗后宫颈癌组织中表达强度均低于化疗前宫颈癌组织中的表达（均P＜0.05）。

根据国家食品药品监督管理总局部署，中国食品药品检定研究院承担了白矾的专项抽验任务，对从全国25个省、市、自治区的91家饮片生产企业抽取的119批样品进行了评价性检验。具体抽样情况见表1。

2.3 化疗前宫颈鳞癌组织中PKM2和mTOR蛋白在化疗有效组和化疗无效组的表达差异 36例巨块型Ⅰb-Ⅱa宫颈鳞癌患者中，19例为化疗有效组，17例为化疗无效组。化疗前宫颈鳞癌组织中PKM2和mTOR蛋白两组中的表达差异，见表2。

由表2可见，化疗前宫颈鳞癌组织中PKM2和mTOR蛋白在化疗有效组中的表达强度均高于化疗无效组（均P＜0.05）。

图2 化疗前、后宫颈鳞癌组织中PKM2的表达[A：化疗前；B：化疗后（SP法，×400）]

3 讨论

研究表明，新辅助化疗的疗效是巨块型Ⅰb和Ⅱa期宫颈癌患者独立的预后因素，对新辅助化疗有效者提示患者有更长的无肿瘤进展时间和总的生存时间[1]。但并非每例患者都对化疗药物敏感，有部分患者对化疗药物耐药，其长时间使用不敏感的药物，则会延误确切的手术和（或）放疗时间。在我们的前期工作中，运用双向电泳技术比较宫颈鳞癌新辅助动脉化疗有效组中化疗前、后的差异蛋白，再用基质辅助激光解析/电离飞行时间质谱来鉴定这些差异蛋白，结果发现宫颈鳞癌组织中PKM2的表达在化疗后的表达明显改变[8]，mTOR是一种高度保守的蛋白质，属于磷脂酰肌醇3激酶/丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶家族。mTOR/PKM2信号传导通路在乳腺癌、结肠癌、淋巴瘤等多种恶性肿瘤中高表达，在调节细胞生长、增殖、存活以及调控细胞周期等多个方面发挥重要的作用[3-4]。国内外研究表明，mTOR/PKM2信号传导通路与恶性肿瘤的化疗疗效相关[5-7]。

欧柳菁等[5]研究发现，mTOR的活化状态与包含紫杉醇方案的乳腺癌新辅助化疗的疗效相关。PKM2在胃癌SNU-638顺铂耐药株中的表达较胃癌SNU-638细胞株中明显下降，抑制胃癌细胞株SNU-638中PKM2的表达会引起对顺铂的耐药[6]。Huang等[7]采用差异蛋白质组学方法分析奥利司他处理后卵巢癌SKOV3细胞系中的差异蛋白，发现PKM2的表达明显下调。mTOR与宫颈癌新辅助化疗疗效之间的相关性仅见Faried等[10]报道，而PKM2与宫颈癌新辅助化疗疗效之间的相关性尚未见报道。

本研究主要通过免疫组化方法检测宫颈鳞癌患者在新辅助动脉化疗前、后mTOR和PKM2蛋白的表达变化，探讨了mTOR和PKM2表达与宫颈鳞癌新辅助动脉化疗疗效的关系及可能的机制。结果显示，与化疗前相比，mTOR和PKM2蛋白在宫颈鳞癌组织中的表达在化疗后均明显下调，推测与顺铂联合化疗药物抑制了肿瘤细胞的糖酵解活动有关。

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（本文编辑：沈昱平）

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mTOR-PKM2 signaling pathway in relation to sensitivity of neoadjuvant intra-arterial chemotherapy for cervical squamous cancer

Objective To explore the relationship of rapamycin(mTOR)-pyruvate kinase M2(PKM2)signaling pathway with the sensitivity of neoadjuvant intra-arterial chemotherapy for patients with cervical squamous cancer．MethodsThirty-six patients with stage Ib or IIa bulky squamous cervical cancer who underwent cisplatin-based neoadjuvant intra-arterial chemotherapy and radical hysterectomy between 2007 and 2012 in Wenzhou Medical University were enrolled．The expression of mTOR and PKM2 protein were examined by Western blotting in cervical squamous cell carcinoma before chemotherapy．The expression of mTOR and PKM2 in tumor was detected by streptavidin peroxidase(SP)immunohistochemical staining before and after chemotherapy and in chemotherapy-response patients and non-response patients．ResultsAfter one or two cycles of chemotherapy,19 cases responded to chemotherapy and 17 cases did not respond．Western blotting revealed than mTOR and PKM2 proteins were positively expressed in cervical squamous cell cancer．The expression of mTOR and PKM2 in tumor cells after chemotherapy was significantly lower than that before chemotherapy(P＜0．05)．Before chemotherapy the expression of mTOR and PKM2 in chemotherapy-response group was significantly higher than that in non-response group(P＜0．05)．ConclusionThe expression of mTOR and PKM2 in early stage cervical squamous carcinoma is associated with the response to neoadjuvant arterial chemotherapy,which may be used as a predictor for response to chemotherapy．

mTOR PKM2 Uterine cervical neoplasms Chemotherapy Neoadjuvant

2013-09-23）

浙江省卫生高层次创新人才资助项目（2010-21）；国家自然科学基金项目（30700195）

325027 温州医科大学附属第二医院妇产科

朱雪琼，E-mail:zjwzzxq@163.com