食管鳞癌中MEKK3和NF-κB的表达及其临床意义

殷宪刚 葛荣 周新成 陈金平 夏朝霞

食管鳞癌中MEKK3和NF-κB的表达及其临床意义

殷宪刚 葛荣 周新成 陈金平 夏朝霞

目的 研究有丝分裂原活化蛋白激酶激酶激酶3（MEKK3）、核转录因子（NF-κB）蛋白在食管鳞癌组织中的表达及其临床意义。方法收集76例食管鳞癌患者的癌组织及相应的35例癌旁异型增生组织和20例正常食管黏膜组织，应用免疫组化EnVision法检测MEKK3、NF-κB蛋白的表达。结果食管鳞癌组织中MEKK3蛋白阳性表达率高于癌旁异型增生组织和正常食管黏膜组织（均P＜0．05）；NF-κB蛋白表达阳性率在正常食管黏膜组、癌旁异型增生组、食管鳞癌组中依次升高；MEKK3、NF-κB蛋白表达与临床分期、浸润深度及淋巴结转移均相关（均P＜0．05），而与患者年龄、性别及组织学分级均无关（均P＞0．05）；MEKK3与NF-κB蛋白的阳性表达呈正相关（r=0．308，P＜0．05）。结论MEKK3、NF-κB蛋白异常表达与食管鳞癌的发生、浸润转移及预后相关，且两者呈正相关。联合检测MEKK3和NF-κB蛋白表达可作为食管鳞癌的诊断、预后评估的参考依据。

有丝分裂原活化蛋白激酶激酶激酶3 核转录因子 食管鳞癌

近年来研究发现，细胞信号转导异常与肿瘤的生物学行为密切相关。核转录因子（nuclear factor kappa B，NF-κB）具有多向调节作用，参与调控体内多种生理和病理过程。有丝分裂原活化蛋白激酶激酶激酶3（mitogen-activated protein kinase/extracellular signal-regulated kinase kinase kinase 3，MEKK3）是一种属于MAP3K家族的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶[1]。既往研究证实MEKK3与乳腺癌、卵巢癌、肝细胞癌等肿瘤的发生、发展密切相关，而MEKK3与NF-κB在食管鳞癌发生中的作用及其相互关系未见报道。本研究采用免疫组化EnVision法检测食管鳞癌组织、癌旁异型增生组织和正常食管黏膜组织中MEKK3、NF-κB蛋白的表达，以探讨MEKK3、NF-κB蛋白异常表达与食管鳞癌发生的关系及其临床意义。

1 对象和方法

1.1 对象 选取本中心2011-06—2012-12食管癌手术切除标本76例，所有病例均经3位病理专家重复读片证实为鳞状细胞癌。癌旁组织距癌组织边缘3cm以内，正常组织取自手术残端，距癌组织3cm以上。以简单随机法从76例标本中选取相应的癌旁异型增生组织标本35例及相对正常的食管黏膜标本20例。患者中男45例，女31例；年龄41～81岁，平均（61.3±7.1）岁；组织学分级：高中分化49例，低分化27例；按UICC（1997）TNM分期：Ⅰ+Ⅱ期47例，Ⅲ+Ⅳ期29例；浸润深度：浅肌层浸润26例，深肌层浸润28例，浆膜层22例；有淋巴结转移31例，无淋巴结转移45例。所有组织标本均固定于4%多聚甲醛中并以石蜡包埋。

1.2 试剂 鼠抗人MEKK3单克隆抗体ab40756为英国Abcam公司产品；鼠抗人NF-κBp65单克隆抗体、EnVision试剂盒及DAB显色试剂盒均购于北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.3 实验方法 采用免疫组化EnVision法检测MEKK3、NF-κB蛋白的表达。参照试剂盒说明书进行操作，用已知的阳性对照片作为阳性对照，以PBS代替一抗作阴性对照。

1.4 结果判定 MEKK3以细胞质内出现棕黄色颗粒者为阳性表达；NF-κB阳性则主要表达于细胞核，呈现棕黄色颗粒。每一张切片随机观察10个高倍视野，每个视野计数100个细胞，共计数1 000个细胞，凡细胞内出现清晰棕黄色颗粒者为阳性细胞，以细胞无棕色或与背景一致的淡棕色为阴性细胞。切片内阳性细胞数＜10%判定为阴性，≥10%判定为阳性。

1.5 统计学处理 采用SPSS 11.0统计软件，计数资料间比较采用χ2检验，相关性分析采用Spearman等级相关分析。

2 结果

2.1 MEKK3和NF-kB蛋白在食管鳞癌组织、癌旁异型增生组织和正常食管黏膜组织中的表达 MEKK3蛋白阳性率在正常食管黏膜组（15.0%）、癌旁异型增生组（44.4%）、食管鳞癌组（84.2%）中依次升高；NF-κB蛋白阳性率也在正常食管黏膜组（10.0%）、癌旁异型增生组（40.0%）、食管鳞癌组（72.4%）中依次升高，组间比较均有统计学差异（均P＜0.05）。食管鳞癌组织中MEKK3和NF-κB呈强阳性表达，见图1-2。

2.2 MEKK3和NF-kB蛋白表达与食管鳞癌患者临床病理特征的关系 MEKK3、NF-κB蛋白表达分别与食管鳞癌临床分期、浸润深度及淋巴结转移相关（均P＜0.05）；而与患者性别、年龄及病理分级无关（均P＞0.05），见表1。

2.3 MEKK3和NF-κB蛋白在食管鳞癌中表达的相关性 在食管鳞癌组织中，MEKK3蛋白阳性率84.2%（64/ 76），NF-κB蛋白阳性率72.4%（55/76），两者共同阳性率65.8%（50/76）。MEKK3和NF-κB蛋白在食管鳞癌组织中的表达呈正相关（r=0.308，P＜0.05）。

图1 MEKK3在食管鳞癌组织中强阳性表达（EnVision法，× 400）

图2 NF-κB在食管鳞癌组织中强阳性表达（EnVision法，× 400）

表1 MEKK3和NF-κB蛋白表达与食管鳞癌患者临床病理特征的关系[例（%）]

3 讨论

食管癌是人类常见的恶性肿瘤之一，也是我国最常见的恶性肿瘤之一。50.0%的食管癌患者在发现时已有远处转移或已经无法进行手术切除，而其发病机制目前尚未完全清楚。因此，研究与食管癌发生、发展及预后相关的细胞信号转导分子对诊断治疗有重要意义。

细胞信号转导异常与肿瘤的恶性生物学行为密切相关，因此肿瘤细胞异常的信号转导已成为肿瘤研究的热点之一[2]。既往研究发现，MAPK和NF-κB信号途径的过度激活与肿瘤的发生、发展及浸润转移密切相关。NF-κB可调控多种细胞因子、生长因子基因的转录表达，参与细胞增殖和凋亡的调节，由此参与调控体内多种生理和病理过程。NF-κB异常活化能保护肿瘤细胞免于凋亡，并与肿瘤的发生、侵袭、转移及耐药相关[3]。MEKK3是一种属于MAP3K家族的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶[2]。该蛋白激酶通过激活包括JNK、p38、ERK5在内的MAPKs和NF-κB信号通路，调控早期胚胎心血管系统的发育、内皮细胞的增殖凋亡、肌细胞的形成并参与各种炎症和免疫应答过程[4]。研究已证明MEKK3是脂多糖、TNF-α及IL-1介导的NF-κB激活的重要调控激酶[5]。MEKK3可激活NF-κB抑制物激酶（IKKs），后者可磷酸化NF-κB复合物中的抑制成分IκB使其激活。NF-κB与IκB结合处于非活化状态，IκB磷酸化后可与NF-κB分离，导致NF-κB的持续活化，活化的NF-κB迁移至核内，在核内起转录因子的作用，可诱导众多炎性相关的基因如TNF-α、IL-6和IL-8等的表达及调控相关癌基因的转录与表达[6]。研究发现，NF-κB过度激活与许多恶性肿瘤有关，如乳腺癌、卵巢癌、肝细胞癌[7]、肺癌等。Samanta等[8]发现乳腺癌和卵巢癌细胞过表达MEKK3蛋白可导致NF-κB活性增强，并与此两种癌细胞持续抵抗凋亡密切相关；Chiao等[9]发现人肝癌Hep3B细胞中MEKK3的高表达可使Rel/NF-κB的活性增加，从而抑制了肝癌细胞的凋亡；Lin等[10]发现MEKK3及其下游信号分子ERK在肺腺癌A549细胞中异常激活与癌细胞的浸润转移密切相关。

本研究结果显示，MEKK3在由正常食管黏膜组织、癌旁异型增生组织到食管鳞癌组织的演进过程中其蛋白阳性表达率依次升高，三者之间有统计学差异。提示MEKK3蛋白的高表达可能成为食管鳞癌发生的早期标志物，对于食管鳞癌的早期诊断有一定的临床意义。进一步研究显示，MEKK3蛋白表达与食管鳞癌临床分期、肿瘤浸润、转移有关，而与患者性别，年龄及组织学分级无关，提示MEKK3可能参与食管鳞癌的浸润转移过程，并可能与患者的预后有关。而NF-κB蛋白阳性率在食管鳞癌组织高于癌旁异型增生组织及正常食管黏膜组织，也具有统计学差异。进一步研究显示，NF-κB表达与食管鳞癌临床分期、肿瘤转移有关，而与患者性别，年龄、肿瘤大小及病理分型无关，表明NF-κB蛋白过表达参与了食管鳞癌的发生、浸润与转移。

此外，本研究还提示MEKK3和NF-κB蛋白在食管鳞癌组织中的表达呈正相关，表明两者可能在食管鳞癌的发生和浸润转移过程中可能起到一定程度的协同作用。由此笔者推测MEKK3表达可能增强NF-κB信号传导通路的活性，最终导致了肿瘤的发生。两者联合检测对于肿瘤早期诊断、预后评价及阐明食管鳞癌的发生、发展机制具有重要临床意义。

[1]Blank J L,Gerwins P,Elliott E M,et al．Molecular cloning of mitogen-activated protein/ERK kinase kinases(MEKK)2 and 3．Regulation of sequential phosphorylation pathways involving mitogen-activated protein kinase and c-Jun kinase[J]．J Biol Chem, 1996,271(10)：5361-5368．

[2] Shirakihara T,Horiguchi K,Miyazawa K,et al．TGF-β regulates isoform switching of FGF receptors and epithelial-mesenchymal transition[J]．EMBO J,2011,30(4)：783-795．

[3] Li W,Tan D,Zenali M J,et al．Constitutive activation of nuclear-factor-kappa B(NF-κB)signaling pathway in fibrolamellar hepatocellular carcinoma[J]．Int J Clin Exp Pathol,2009,3(3)：238-243．

[4] Yang J,Boerm M,Mccarty M,et al．MEKK3 is essential for early embryonic cardiovascular development[J]．Nat Genet,2000,24 (3)：309-313．

[5]Huang Q,Yang J,Lin Y,et al．Differential regulation of interleukin 1 receptor and Toll-like receptor signaling by MEKK3[J]．Nat Immunol,2004,5(1)：98-103．

[6]Yang J,Lin Y,Guo Z,et al．The essential role of MEKK3 in TNF-induced NF-kappa B activation[J]．Nat Immunol,2001,2(7)：620-624．

[7]金亦,邵春奎,唐录英,等．肝细胞癌中Survivin与NF-κB蛋白的表达及其临床意义[J]．中华医学杂志,2011,91(36)：2542-2545．

[8]Samanta A K,Huang H J,Le X F,et al．MEKK3 expression correlates with nuclear-factor-kappaB activity and with expression of antiapoptotic genesin serous ovarian carcinoma[J]．Cancer,2009, 115(17)：3897-3908．

[9] Chiao P J,Na R,Niu J,et al．Role of Rel/NF-kappaB transcirption factors in apoptosis of human hepatocellular carcinoma cells[J]．Cancer,2002,95(8)：1696-1705．

[10] Lin S S,Lai K C,Hsu S C,et al．Curcumin inhibits the migration and invasion of human A549 lung cancer cells through the inhibition of matrix metalloproteinase-2 and-9 and vascular endothelial growth factor(VEGF)[J]．Cancer Lett,2009,285(2)：127-133．

Expression of MEKK3,NF-κB proteins in esophageal squamous cell carcinoma and their clinical significance

Objective To study the expression of mitogen-activated protein kinase/extracellular signal-regulated kinase kinase kinase 3(MEKK3)and nuclear factor kappa B(NF-κB)proteins in esophageal squamous cell carcinoma(ESCC)and their clinical significance．MethodsThe expression of MEKK3 and NF-κB proteins in 76 cases of ESCC,35 cases of adjacent atypical hyperplasia tissues and 20 cases of normal tissue were detected by immunohistochemistry EnVision method．ResultsThe positive rates of MEKK3 protein in ESCC tissue were significantly higher than those of atypical hyperplasia tissue and normal tissue(P＜0．05)．The positive rates of NF-κB protein were increased gradually in ESCC tissue,atypical hyperplasia tissue and normal tissue．In ESCC tissue,the positive expression of MEKK3 and NF-κB proteins was both correlated with the clinical stage,infiltration depth and lymph node metastasis(all P＜0．05),but not correlated with age,sex,or degree of differentiation(all P＞0．05)．Expression of MEKK3 protein was positively associated with expression of NF-κB(r=0．308,P＜0．05)．ConclusionThe expression of MEKK3 and NF-κB proteins can be used as a indicator for the diagnosis of ESCC and the prognosis of patients．

MEKK3 NF-κB Esophageal squamous cell carcinoma

2013-05-27）

（本文编辑：胥昀）

315031 宁波市临床病理诊断中心诊断部

殷宪刚，E-mail:yinxiangang@126.com