RP-HPLC法测定香椿叶中槲皮素-3-O-α-L-鼠李糖苷

顾芹英， 李慧华， 秦 冬，2， 郭 敏， 杨 欢*， 贾晓斌，2*

（1.江苏大学药学院， 江苏 镇江 212013； 2.江苏省中医药研究院， 国家中医药管理局中药口服制剂释药系统重点研究室， 江苏 南京 210028）

RP-HPLC法测定香椿叶中槲皮素-3-O-α-L-鼠李糖苷

顾芹英1， 李慧华1， 秦 冬1，2， 郭 敏1， 杨 欢1*， 贾晓斌1，2*

（1.江苏大学药学院， 江苏 镇江 212013； 2.江苏省中医药研究院， 国家中医药管理局中药口服制剂释药系统重点研究室， 江苏 南京 210028）

目的 建立测定中 药 香 椿叶中槲 皮 素-3-O-α-L-鼠李糖 苷 的反相高 效 液相色谱 法。 方 法 采 用 Waters XBridge Shield RP18色谱 柱 （ 4.6 mm × 150 mm， 5 μm） ， 流 动 相 为 乙 腈 -0.1% 甲 酸 水 溶 液 （20 ∶80） ， 体 积 流 量 为 1.0 m L/m in， 检测波长为 254 nm， 柱温为 40 ℃。 结果 在以上色谱条件下， 供试品溶液中的槲皮素-3-O-α-L-鼠李糖苷与干扰成分完全分离， 其在 5.260 ～105.2 mg/mL范围内线性关系良好 （r2=0.999 1）， 重复性实验 RSD=1.96% （n= 6）， 平均加样回收率为 99.3% ～104.1% （n=3）， RSD为 4.23% ～4.78%。 结论 6 个产地香椿叶中槲皮素-3-O-α-L-鼠李糖苷的量分别为 0.826% ±0.025% （山西运城）、 0.271% ±0.006% （河南西平）、 0.459% ±0.016% （河南焦作）、 0.222% ±0.006% （四川简阳）、 0.808% ±0.019% （山东西牟） 和 0.293% ±0.008% （江苏镇江）。

香椿； 香椿叶； 槲皮素-3-O-α-L-鼠李糖苷； 反相高效液相色谱法

中药香椿叶 Toonae sinensis Folium为楝科 Meliaceae乔 木 香 椿 Toona sinensis Roem 的 干 燥 树叶［1-2］， 味苦、 性温， 无 毒， 有清热收敛、 消 炎 解毒、去燥湿等功效，临床上常用于治疗肠炎、痢疾等疾病［3］。 由于其突出的疗效以及世界范围内对天然抗氧化剂的旺盛需求，近几年里，对该中药的抗氧化活性和相应有效化学成分的研究较为深入［4-9］。 活性筛选试验发现， 从香椿叶中分 离得到的众多多酚类化合物之中， 槲皮素-3-O-α-L-鼠李糖苷具有较 强 的 抗 氧 化 作 用［10-11］， 被 认 为 是香 椿 叶中的重要活性物质之一。

目前， LC-MS 已用于鉴别香椿叶中的没食子酸及其衍生物等［2，12］。 然而， 对于槲皮素-3-O-α-L-鼠李糖苷这一香椿叶中的重要活性物质，其定量分析方法以及不同产地药材中该化合物的量比较至今尚未见任何报道。因此，本实验建立了香椿叶中槲皮素-3-O-α-L-鼠李糖苷的反相高效液相色谱分析方法，并测定了6个产地香椿叶中该化合物，从而为香椿叶的质量评价提供参考。

1 仪器与材料

Waters XBridgeShield RP18色谱柱 （4.6 mm × 150 mm， 5 μm）； Mettler-Toledo AE240 电子分析天平 （0.01 mg）； 乙腈 （色谱纯， Honeywell）， 甲酸（分析纯， 国药集团上海化学试剂有限公司）， 甲醇 （分析纯， 成都科龙化工试剂厂）， 双蒸水为实验室自制； 槲皮素-3-O-α-L-鼠李糖苷为本实验室分离得到， 并经1H-NMR和13C-NMR鉴定。

香椿叶分别采收自河南西平 （2012 年 7 月）、河南焦作 （2012 年 8 月）、 山西运城 （2011 年 8月）、 四川简阳 （2012 年 6 月）、 山东西牟 （2011年7 月）和江苏镇江 （2013 年 7 月）， 并经江苏大学生药学研究所陈钧教授鉴定为 T.sinensis的叶。鲜叶置通风处阴干， 粉碎后过 40 目筛， 收集细粉供分析用。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 Waters XBridge Shield RP18色谱柱（150 mm ×4.6 mm， 5 μm）； 流动相为乙腈 -0.1%甲酸水溶液 （20 ∶80）； 体积流量 1.0 mL/min； 检测波长 254 nm； 柱温 40 ℃； 进样量 20 μL。

2.2 对照品贮备液的制备 精密称取槲皮素贮备液-3-O-α-L-鼠李糖苷对照品 10.52 mg， 加 60%甲醇溶解并定容至 50 m L， 配制成质量浓度为 210.4 μg/mL的对照品贮备液。

2.3 供试品溶液的制备 取香椿叶细粉 0.100 g，精密称定， 置 50 m L具塞离心管中， 精密加入60%甲醇 25 m L， 称重， 超声提取 15 min， 冷却至室温， 加 60%甲醇补足失质量， 取上清液， 0.20 μm微孔滤膜滤过， 弃去初滤液5 mL， 取续滤液作为供试品溶液，待测。

2.4 线性关系考察 分别精密吸取 “2.2” 项下对照品贮备液 5、4、 3、 2、 1 mL， 移入 10 mL量瓶中， 加入 60%甲醇稀释至刻度， 摇匀，得质量浓 度 为 105.2、 84.16、 63.12、 42.08、 21.04 μg/mL对照品溶液； 再将 21.04 μg/m L对照品溶液进行两次二倍稀释， 分别得到质量浓度为 10.52 μg/mL和 5.260 μg/mL的对照品溶液； 以上 7 份溶液按照 “2.1” 项色谱分析条件进样测定。 以峰面积 （Y） 为纵坐标， 质量浓度 （X， μg/mL） 为横坐标进行线性回归，计算得回归方程为 Y= 42 087.120 7X-4 170.292 5， r2=0.999 1。

2.5 精密度考察 分别吸取低、 中、 高 3 个质量浓度的对照品溶液和供试品溶液 （江苏镇江样品）， 按照 “2.1”项下方法测定峰面积，每个质量浓度重复进样 6 次，计算得槲皮素-3-O-α-L-鼠李糖 苷 的 峰 面 积 RSD 分 别 为 1.41%、 1.95%、1.87%和 0.90%， 表明仪器的进样精密度良好。

2.6 稳定性考察 吸取同一份供试品溶液 （江苏镇江样品，室温下保存）， 分别于 0、 2、 4、 6、 8、 12、 24、 36、 48 h， 按照 “2.1” 项下方法测定，计算得该化合物峰面积的 RSD为 1.53%， 表明在48 h内供试品溶液的性质稳定。

2.7 重复性试验 按照 “2.3” 项下方法制得供试品溶液 6 份 （江苏镇江样品）， 按照 “2.1” 项下方法测定，计算该化合物在药材中含有量的RSD为 1.96%， 表明该方法的重复性良好。

2.8 加样回收率试验 取已测定含有量的药材粉末 9 份 （江苏镇江样品）， 每份 50.0 mg， 精密称定，精密加入一定量的对照品溶液 （高、中、低3种加入量， 各重复 3 次）， 用 60% 甲醇补足至25 mL， 其余按照 “2.3” 项下方法制得供试溶液共 9 份， 并按照 “2.1” 项下测定， 计算加样回收率， 和 RSD， 结果如表1 所示。

表1 加样回收率实验结果Tab.1 Results of recovery tests

2.9 样品测定 按照 “2.3” 项下方法制得 6 批药材供试品溶液各 3 份， 按照 “2.1” 项下方法测定峰面积，代入回归方程，并计算所测成分在药材中的百分含有量。 结果显示， 香椿叶中槲皮素-3-O-α-L-鼠李糖苷的含有量分别为 0.826% ±0.025% （山西运城）、0.271% ±0.006% （河南西平）、 0.459% ±0.016%（河 南 焦 作）、 0.222% ±0.006% （ 四 川 简 阳）、0.808% ±0.019% （山东西牟） 和 0.293% ±0.008%（江苏镇江）。 色谱图见图1、 图2。

图1 对照品溶液的高效液相色谱图Fig.1 HPLC chromatogram of the reference solution

图2 6个产地香椿叶的高效液相色谱图Fig.2 HPLC chromatograms of samples from six habitats

3 结论与讨论

3.1 实验中比较了 4 根色谱柱， 即 Agilent Zorbax Eclipse XDB-C8（ 4.6 mm × 150 mm， 5 μm） 、Thermo ODSHypersil（4.6mm ×150mm， 5 μm） 、Merck Chromolith Performance RP-18e（4.6 mm × 100 mm， 5 μm） 、 Waters XBridge Shield RP18（4.6 mm × 150 mm， 5 μm） ， 最 终 发 现 使 用 Waters XBridgeShield RP18（4.6 mm × 150 mm， 5 μm）时，出峰时间适中，峰对称性好，并且可与其他峰达到基线分离，最终为本实验采用。

3.2 实验中比较了不同体积分数甲醇 （20%、40%、 60%、 80%和 100%） 为溶剂以及不同超声时长 （15 min、 30 min、 45 min 和 60 min） 的 提 取效果， 发现以 60%甲 醇 超 声 提 取 香 椿 叶粉末 15 min， 槲皮素-3-O-α-L-鼠李糖苷的色谱峰面积最大。3.3 对从不同产地采收得到的香椿叶样品进行测定的结果表明，山东西牟、山西运城和河南焦作产香椿叶中槲皮素-3-O-α-L-鼠李糖苷的量明显高于江苏镇江、河南西平、四川简阳三个产地，而山东、山西和河南是香 椿 的 道 地 产 区［13］， 可 见 该 化 合 物的量与香椿药材的道地性呈现正相关。

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Determ ination of quercetin-3-O-α-L-rhamnoside in Toonae sinensis Folium by RP-HPLC

GU Qin-ying1， LIHui-hua1， QIN Dong1，2， GUO Min1， YANG Huan1*， JIA Xiao-bin1，2*

（1.School of Pharmacy， Jiangsu University， Zhenjiang 212013， China； 2.Key Lab of ChineseMedicine Delivery System of SATCM， Jiangsu Provincial Academy of ChineseMedicine， Nanjing 210028， China）

Toona sinensis； Toonae sinensis Folium； quercetin-3-O-α-L-rhamnoside； RP-HPLC

R284.1

： A

： 1001-1528（2014）03-0577-03

10.3969/j.issn.1001-1528.2014.03.028

2013-08-06

江苏省自然科学基金 （BK2012290）； 常州市科技支撑计划 （CE20125042）； 江苏大学高级人才科研启动基金 （11JDG073）；江苏大学学生科研立项项目 （12A491）

顾芹英 （1990—）， 女， 硕士生， 研究方向： 中药学。

*通信作者：杨 欢，男，副教授。贾晓斌， 男， 教授， 研究方向： 中药物质基础。 Tel：（025）85608672， E-mail： jxiaobin2005@hotmail.com