虚拟筛选预测固本止咳膏的作用靶标

陈海燕， 李秉佳， 史胜楠

（广西大学化学化工学院， 广西 南宁 530004）

虚拟筛选预测固本止咳膏的作用靶标

陈海燕， 李秉佳， 史胜楠

（广西大学化学化工学院， 广西 南宁 530004）

目的 应用虚拟筛选方法预测固本止咳膏的活性成分及其作用靶标，以期阐明固本止咳膏活性成分的协同机制。 方法 通过文献收集固本止咳膏复方原材料有关的 117 个化合物。 选取三个炎症中关键酶 6COX、 1A4G、 1LRY作受体， 应用 iGEMDOCK软件对 117 个化合物分子进行分子对接， 发现了 19 个活性分子。 再用 SePreSA进行反向分子对接预测这些活性成分的作用靶标。结果 预测了固本止咳膏中活性成分及其分子靶标。结论 初步阐释固本止咳膏在抗炎、抗菌和抗病毒方面的作用机制，为下一步研究壮药固本止咳膏的作用靶标选取提供理论指导，为复方壮药开发提供一种新的研究策略。

壮药；固本止咳膏；活性成分；虚拟筛选；分子对接；作用靶标

固本止咳膏源于壮族秘方，以白蚁菌圃与黄芪、五味子、淫羊藿、矮地茶、苦杏仁配伍而成［1］，具有止咳祛痰的作用［2］。 既往对其原材提取物的成分和药效已有研究［3-4］， 其中 主药白蚁菌圃具有抗炎、 增强免疫力 等作用［5-6］， 但对 其活性成分分子作用机制尚不明确。这也是壮族医药现代化开发和推广的常见问题，而对活性成分的研究有助于提高质量控制和增强药物安全，更可使之与国际标准接轨，推动其得到广泛应用。

囿于固本止咳膏原药材成分复杂，若运用传统的药理研究方法破译难度高、周期长、投资大，而使用计算机辅助药物设计 CADD技术可避免此问题。随着将虚拟筛选和高通量筛选结合，新配体识别的技术得到发展［7］。 同时， 虚拟筛选能较好地从化合物中筛选出活性成分［8］。 本实验利用挖掘文献的方法和虚拟筛选工具结合，筛选固本止咳膏原药材中具有抗炎活性的分子并预测其作用靶标，以期阐明固本止咳膏活性成分的分子协同机制，为民族医药的现代化开发奠定理论基础。

1 方法

1.1 材料

1.1.1 配体库的构建 本实验以固本止咳膏原药材中化学成分为研究对象， 通过文献 ［9-11］ 挖掘共计 117 个化合物。 化合物分子采用 Chem Office、Open Babel（http： //openbabel.org） 等构建成三维结构， 并对 其加氢、 加电荷，保 存 为 mol2 格式，作为虚拟筛选的配体库。

1.1.2 受体选择 咳嗽痰饮的临床表现有咳痰、哮喘、咳嗽。主要病因是细菌、病毒感染，真菌、衣原体、支原体致使上呼吸道炎症，发展到喉、气管、肺部等病变。故而从蛋白质晶体结构数据库（http： //www.rcsb.org） 中选择在炎症的表达和调节 中 关 键 酶 COX-2 为 受 体 蛋 白 （ PDB code：6COX［12］）。 同时， 选取两个病毒和细菌合成的关键酶神经氨酸苷酶 （ PDB code：1A4G［13］）、 肽脱甲酰化酶 （ PDB code： 1LRY［14］） 作为受体蛋白。

1.2 方法

1.2.1 分子对接和评价方法 分子对接是将化合物分子放入受体蛋白配体结合位点，通过研究受体结构特征及其与化合物分子之间作用力，依据让两者在几何、能量上匹配的原则而相互识别，筛选出结合能量最低的分子［15］。

采用 iGEMDOCK［16］（ GA parameters： Population size=200， Generation=70， Number of solution= 2， Binding site radius=8Å） 对化合物分子和受体蛋白的结合腔穴进行对接。蛋白质上基团通过范德华力、氢键和静电作用与化合物分子结合，匹配出能力最低的结合位点。能量函数根据对分子对接结果的范德华力、氢键和静电作用统计，并将能量转换成单位 kcal/mol。

1.2.2 作用靶标预测 活性分子之间， 具有共同特征的如化学基团、 氢键给/受体、 正/负电基团和疏水性基团等，以化合物分子的结构信息和生物活性为基点，找到共同的药效作用本质。作用靶标预测是在不知靶点情况下，让活性分子和有可能的多个靶标的三维结构对接， 寻找潜在靶标［17］。

通过 SePreSA （ http： //sepresa.bio-x.cn/） 服务器，将化合物分子的三维结构上传，服务器将化合物分子和蛋白质晶体结构数据库中蛋白质进行结合。筛选出对化合物分子有敏感作用的氨基酸残基，以期阐明化合物分子在产生药效过程中的副作用及解释其中药物动力学，评估化合物分子的安全性［18］。

2 结果

2.1 以 1A4G、 1LRY、 6COX为受体， 通过将化合物分子与之对接， 筛选出打分排在前19的分子，以 ZMR［19］、 BB2［20］、 SC58［21］为 对接结果阳 性 对照， 并对其进行排序 （见表1）， 能量较低者表示化合物分子与受体结合的构象稳定，发生的作用可能性大，而且多数分子的对接能量比相应的阳性对照物的能量要大，即可成为相关酶的抑制剂。

表1 分子对接数据Tab.1 Docking score

2.2 药物的潜在靶标的识别对于药物的研发、使用过程中的分子生理活性和毒性等有重要意义。同时，据此能挖掘药物的适用性，有利于其在老药新用等领域的发展。作为一种快速而低成本的技术，计算机辅助识别分子靶标的算法应用甚广，根据SePreSA服务器所设定算法［18］，选出结果 Z'-scores＜-0.5 且 Z-scores＜-1.2 的靶标 （ 见表 2）。

3 讨论

固本止咳膏6种原药材化学成分复杂，其中黄芪、五味子等在方剂配伍使用较多。采用单一药材的研究不足以体现中药复方的系统性。中药有“药有个性之长，方有合群之妙” 的说法，即配伍药材之间存在相互协同效用。依靠对中药成分的分离提纯后进行药理实验流程复杂、周期长、成本高，只能适用小规模筛选。利用计算机虚拟筛选的方法实验具有导向性，加快了中药复方的机理研究过程［22］。 中药方剂青黛片治疗急性早幼粒白血病的分子机理的分析，首次阐述方剂 “君、 臣、佐、使” 的配伍原则［23］。

表2 作用靶标预测结果Tab.2 Result of virtual screening

固本止咳膏作为传统壮药，其原药材的鉴定和分析的深入研究已有报道，中药配伍对化学成分的影响指出合理的方剂有助于药效的释放［24］。 但囿于客观条件，依据传统方法弄清化合物分子的生理活性仍是一项困难的工作。文中数据表明，打分排在前的化合物分子在与 COX-2 结合具有稳定构象，君药白蚁菌圃中的 Ursolic acid、 佐药苦杏仁、 矮地茶中的 Amygdalin、 Quercetin、 Kaempferol等指出方剂止咳祛痰的活性成分，验证了其传统医理中具有治疗炎症的作用。 而臣药黄芪的 Rutin 和五味子中木脂素类化合物与神经氨酸苷酶、肽脱甲酰化酶的对接结果说明其在抗菌和抗病毒方面也具有疗效，补充解释方剂效用。

同时，研究中发现潜在的作用靶标中涉及药效范围面广， 如蛋白质 Poly［ADP-ribose］ polymerase 1 具有生理毒性等。 由蛋白质 Mitogen-activated protein kinase 1 （MAPK） 形成的信号通路， 接受外界刺激可调节真核生物基因表达，化合物分子与之结合而影响真核生物的生长发育、分化凋亡。方剂中的化合物分子通过分子间作用力与之结合，作为潜在的抑制剂，或可改变调节机制。我们也注意到化合物分子能与蛋白质 Histamine N-methyltransferase（HMT） 结合而影响 HMT对组胺代谢的作用。 表明使用固本止咳膏的使用可能影响组胺参与睡眠和食欲调节的功能，是潜在的药物安全性能的指标。

方剂与其他药物混合使用时存在药物的协同拮抗作 用。 如 蛋 白 质 Arylamine N-acetyltransferase 2（NATs） 可与化合物 Deoxyschizandrin、 Schisandlignan A等结合， 从而影响 NATs催化基于辅酶 A乙酰化致癌芳香胺类化合物的过程，拓展了对癌病发病和抗癌药物的代谢机制的研究。Anwuweizic acid在抑制蛋白质 Cholinesterase的同时， 延缓了可卡因代谢，也增加了可卡因使用的潜在风险。据此，固本止咳膏除了在抗炎病症上能发挥作用外尚有治疗其他病症的效用等待发掘。

值得注意的是，实验中只对固本止咳膏原材中的117 个化合物分子进行了研究， 同时也只挑选了炎症中的3个关键酶，这显然是不够的。药物在人体代谢过程的机制等很多问题尚待深入研究。

4 结论

本实验确定了固本止咳膏中抗炎、抗菌和抗病毒的主要活性成分以及其主要的作用靶标，这有助于阐释固本止咳膏的分子作用机制，明确临床定位和提高临床有效性及安全性评价与合理用药，并为中药复方和壮族传统医药提供一个新的研究策略，使用计算机从复杂体系中虚拟筛选出活性成分的方法简单、周期短，从而减低研究费用，提高研究效率。

［1］ 黄瑞松，陈燕军，苏 青，等.固本止咳膏质量标准的研究［J］.中国实验方剂学， 2003； 9（4）： 1-4.

［2］ 李爱媛，黄瑞松， 谢沛珊，等.固本止咳膏的药效研究［J］.中国实验方剂学杂志， 2004， 10（5）： 38-41.

［ 3 ］ 范曾丽， 权秋梅.淫羊藿的药理研究进展［J］.安徽农业科学， 2012， 40（17）： 9264-9266.

［4］ 王玉刚，吴 昊，孟 甄，等.黄芩总黄酮对金葡菌肺感染模式识别受体 TLR2/Nod2 及其相关炎性因子表达的影响［J］.中国药理学通报， 2009， 25（7）： 866-870.

［5］ 曹 娟，孙 涛，张 敏，等.白蚁菌圃的抗炎作用研究［J］.中药材， 2006， 29（10）： 1011-1013.

［6］ 黄瑞松，叶琦莉，陈 超，等.壮药土垅大白蚁菌圃水提醇溶物对小鼠免疫功能的影响［J］.中国中医药科技，2005， 12（6）： 382-383.

［ 7 ］ Edwards B S.Bologa C， Young M S， etal.Integration of virtual screeningwith high throughput flow cytometry to identify novel small molecule formylpeptide receptor antagonists［ J］ .Mol Pharmacol， 2005， 68（5）： 1301-1310.

［ 8 ］ Muegge I.Selection criteria for drug-like compounds［ J］ .Med Res Rev， 2003， 23（3） ： 302-321.

［ 9 ］ 黄文倩， 李 丽， 肖永庆， 等.HPLC同时测定五味子中6 种木脂素类成分［J］.中国实验方剂学杂志， 2011， 17（10）： 63-66.

［10］ 薛德钧， 周 慧， 张 敏， 等.白蚁菌圃的水溶性化学成分研究［J］.中药材， 2005， 28（10）： 873-874.

［11］ 邱勇波， 刘 锦， 武 飞， 等.黄芪化学成分及药理作用研究进展［ J］ .中国疗养医学， 2011， 20（5） ： 435-436.

［12］ 陈 君， 罗永煌.环氧合酶及其抑制剂的研究进展［J］.中国动物保健， 2011， 13（4）： 15-18.

［13］ 樊林花， 刘田福， 郭 民， 等.五昧子乙素抑制染二氧化硅大鼠肺组织环氧合酶-2 mRNA和前列腺素 E2 表达［J］.中国药理学与毒理学杂志， 2012， 26（1）： 68-72.

［14 ］ Guilloteau J P， Mathieu M， Giglione C， et al.The crystal structures of four peptide deformylases bound to the antibiotic actinonin reveal two distinct types： a platform for the structurebased design of antibacterial agents.［ J］ .Mol Biol， 2002，320（5）： 51-62.

［15］ 叶德举， 罗小民， 沈建华， 等， 先导化合物的发现——整合计算机虚拟筛选、 化学合成和生物测试方法［J］.化学进展， 2007， 19（12）： 1939-1946.

［16 ］ Yang JM， Chen C C.Structure， function and bioinformatics［J］ .Proteins， 2004， 55（2） ： 288-304.

［17 ］ Lyne P D.Structure-based virtual screening： an overview［ J］. Drug Discov， 2002， 7（20）： 1047-1055.

［18 ］ Lun Y， Heng L， Jian C， et al.SePreSA： a server for the prediction of populations susceptible to serious adverse drug reactions implementing themethodology of a chemical-protein interactome［ J］ .Nucleic Acids Res， 2009， 37（ Web Server issue）：W406-W412.

［19 ］ Taylor N R， Cleasby A， Singh O， et al.Dihydropyrancarboxamides related to zanamivir： a new series of inhibitors of influenza virus sialidases.2.Crystallographic and molecular modeling study of complexes of 4-amino-4 H-pyran-6-carboxamides and sialidase from influenza virus types A and B［ J］ .J Med Chem， 1998， 41（6）： 798-807.

［20］ Guilloteau J P， Mathieu M， Giglione C， et al.The crystal structures of four peptide deformylases bound to the antibiotic actinonin reveal two distinct types： a platform for the structurebased design of antibacterial agents［ J］ .JMol Bio， 2002， 320（5）： 951-962.

［21 ］ Kurumbail R G， Stevens A M， Gierse JK， etal.Structuralbasis for selective inhibition of cyclooxygenase-2 by anti-inflammatory agents［ J］ .Nature， 1996， 384（6610） ： 644-648.

［22］ Bureeva S， Andia-Pravdivy J， Kaplun A.Drug design using the example of the complement system inhibitors'development［ J］. Drug Discov， 2005， 10（22） ： 1535-1542.

［23 ］ Wang L， Zhou G B， Liu P， et al.Dissection ofmechanisms of Chinesemedicinal formula Realgar-Indigo naturalis as an effective treatment for promyelocytic leukemia［ J］ .PANS， 2008，105（12）： 4826-4831.

［24］ 罗 毅， 杨 俊， 张倩睿， 等.配伍黄芪对淫羊藿主要化学成分的影响［J］.中国中医药信息杂志， 2006， 13（12）：46-48.

Predicting target of Guben Zhike Electurary by virtual screening

CHEN Hai-yan， LIBing-jia， SHISheng-nan
（1.School of Chemistry&Chemical Engineering， Guangxi University， Nanning 530004， China）

AIM In order to elaborate the collaborativemechanism of active compounds in Guben Zhike Electurary， amethod of virtual screeningwas proposed to forecast Guben Zhike Electurary’s active compounds and targets.METHODS Firstly， 117 compounds of Guben Zhike Electurary were collected through literature and other materials.Secondly， the 19 active compounds were found in the 117 compounds， which were docked with 3 key enzymes（pdb code： 6COX， 1A4G and 1LRY， which was the targetof the anti-inflammatory， antibacterial and antiviral， respectively） by iGEMDOCK.Finally， the 19 active compounds'targetswere predicted by the reverse docking software SePreSA.RESULTS Active compounds and targetof Guben Zhike Electurary were confirmed.The mechanism of action in anti-inflammatory， antibacterial and antivirus were explained.CONCLUSION All above will lay the foundation of further study of Guben Zhike Electurary， and provide new strategies ofmodern development of compound of Zhuangmedicine at the same time.

Zhuangmedicine；Guben Zhike Electurary； active compounds；virtual screening； dock； target

R284.1； R289.9

： A

： 1001-1528（2014）03-0559-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2014.03.024

2013-05-09

梧州市科技局-广西大学校市对接项目 （2011）

陈海燕 （1976—） ， 男， 博士， 副教授， 从事天然产物研究与开发、 中药现代化。 E-mail： czyzsu@163.com