紫癜颗粒有效组分定量测定

张 颖， 王光函， 赵 玥， 吴 怡， 邹桂欣

（辽宁省中医药研究院， 辽宁 沈阳 110034）

紫癜颗粒有效组分定量测定

张 颖*， 王光函， 赵 玥， 吴 怡， 邹桂欣

（辽宁省中医药研究院， 辽宁 沈阳 110034）

目的 建立紫癜颗 粒 的 定量 分 析 方 法。 方 法 采 用 HPLC-ELSD法测 定 制 剂 中 黄 芪 甲 苷， 使 用 Kromasil C18（4.6 mm×200 mm， 5 μm） 色 谱 柱， 以 乙 腈-水 （ 36 ∶64） 为 流 动 相， 体 积 流 量 1.0 mL/min， 柱 温 25 ℃， Alltech 2000ES 蒸发光散射检测器 （漂移管温度 105 ℃； 载气体积流量 3.0 L/min）； 采用 HPLC-DAD法测定制剂中芦荟大黄素、 大黄酸、 大黄素、 大黄酚、 大黄素甲醚的量， 使用依利特 Hypersil BDSC18（4.6 mm×200 mm， 5 μm） 色谱柱，以甲醇-0.2%磷酸水溶液为流动相进行梯度洗脱， 体积流量 1.0 mL/min， 检测波长 254 nm， 柱温 25 ℃。 结果 黄芪甲苷、 芦荟大黄素、 大黄酸、 大黄素、 大黄酚、 大黄素甲醚的线性范围分别为 0.53 ～3.18 μg（r=0.999 3）， 5.15 ～51.5 ng（r=0.999 9）， 5.04 ～50.4 ng（r=1）， 9.68 ～96.8 ng（r=1）， 27.2 ～272 ng（r=1）， 2.68 ～26.8 ng（r= 1）； 平均回收率 （n=9） 为 95.6% ～104.5%， RSD为 0.2% ～2.6%。 结论 所建方法简便、 准确， 重复性好， 可作为此制剂的定量方法。

紫癜；黄芪甲苷；芦荟大黄素；大黄酸；大黄素；大黄酚；大黄素甲醚

紫癜颗粒是辽宁中医药大学附属医院的协定方，由黄芪、酒大黄、太子参、阿胶和甘草等九味中药组成。制备工艺如下：酒大黄乙醇提取，减压干燥至干，粉碎；阿胶减压干燥至干，粉碎；太子参等其余七味药材加水提取，减压干燥至干，粉碎，与酒大黄浸膏粉合并，以阿胶粉和适量糊精为底料， 采用 70%乙醇湿法制成颗粒。 经过长期的临床实践与药理实验研究证实，其能明显提升外周血小板计数并有效控制特发性血小板减少性紫癜ITP出血症状， 可显著改善因大量使用激素而致股骨头坏死等并发症。本实验采用高效液相色谱法对制剂的有效组分黄芪甲苷、芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚和大黄素甲醚进行定量研究，为建立该制剂的质量控制方法提供了参考依据。

1 仪器与试药

Agilent1100 高效液相色谱仪： 四元泵、 DAD检测器； Alltech-ES2000 检测器。 黄芪甲苷、 芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚和大黄素甲醚的对照品均购于中国药品生物制品检定所 （批号分别为110781-200613、 110795-201007、 110757-200206、110758-200110、 110796-201118 和 110758-201013 ）；乙腈、甲醇、磷酸为色谱纯；其他试剂均为分析纯；供试品由辽宁省中医药研究院药学室提供，批号分别为 20120801、 20120802、20120803。

2 方法与结果

2.1 黄芪甲苷的测定［1］

2.1.1 色谱条件 Kromasil C18色谱柱 （4.6 mm× 200 mm， 5 μm）； 流动相为乙腈-水 （36 ∶64）；体积流量 1.0 mL/min， 柱温 25 ℃， 蒸发光散射检测器 （ 漂 移 管 温 度 105 ℃； 载 气 体 积 流 量 3.0 L/min）。

2.1.2 溶液的制备

2.1.2.1 对照品溶液 取黄芪甲苷对照品适量，精密称定， 加甲醇制成每 1 m L含 0.106 mg的溶液，即得。

2.1.2.2 供试品溶液 取装量差异项下的本品，研细， 取5 g， 精密称定， 置索式提取器中， 加甲醇100 mL， 加热回流 2 h， 提取液蒸干， 残渣加水50 mL， 微热使溶解， 用水饱和的正丁醇振摇提取4 次， 每次20 mL， 合并正丁醇液， 用氨试液洗涤3 次， 每次50 mL， 弃去氨试液， 再用正丁醇饱和水50 m L洗涤1 次， 弃去水洗液， 正丁醇液蒸干，残渣加甲醇溶解，转移至5 mL量瓶中，加甲醇至刻度， 摇匀， 滤过， 取续滤液， 过 0.45 μm微孔滤膜，即得。

2.1.2.3 阴性样品溶液 按处方比例取药材， 除去黄芪片，按工艺制备阴性样品。 取阴性样品5 g，按 “2.1.2.2” 项下制备阴性供试液。

2.1.3 系统适应性试验 精密吸取阴性供试液、供试品溶液及黄芪甲苷对照品溶液，分别注入液相色谱仪中，记录色谱图，见图1。 结果表明： 阴性供试液色谱图中，在与黄芪甲苷对照品相同保留时间处未见相应色谱峰干扰，实验方法的专属性良好。 理论板数按黄芪甲苷峰计算应不低于 4 500。

图 1 黄芪甲苷 HPLC-ELSD色谱图Fig.1 HPLC-ELSD chromatogram s for determ ination of astragaloside

2.1.4 线性关系考察 分别精密吸取黄芪甲苷对照品溶液 5、10、 15、 20、 25、 30 μL注入液相色谱仪中，以进样量对数为横坐标，峰面积对数为纵坐标 进行线 性回归， 线性 方程为 Y=1.489X+ 2.962， r=0.999 3。 说明黄芪甲苷进样量在 0.53 ～3.18 μg范围内线性关系良好。

2.1.5 精密度试验 精密吸取黄芪甲苷对照品溶液 20 μL， 平行 6 次， 注入液相色谱仪中， 测定，黄芪甲苷对照品溶液峰面积的 RSD为1.1%， 精密度结果良好。

2.1.6 稳定性试验 取同一供试品溶液， 分别在放置0、 3、 6、 12、 15、 18 h 时， 注入液相色谱仪中， 测定，计算， RSD为 3.5%， 说明供试品溶液在18 h内基本稳定。

2.1.7 重复性试验 取批号为 20120801 的本品100 g， 研细， 取 5 g， 平行 6 份， 精密称定， 按“2.1.2.2” 项下方法制备供试品溶液，分别精密吸取供试品溶液 20 μL， 注入液相色谱仪中， 测定，计算，结果6份样品中黄芪甲苷含有量均值为126.2 μg/g， RSD为 2.7%。

2.1.8 加样回收试验 取批号为 20120801 的本品100 g，研细， 取 2.5 g， 平行 9 份，分 3 种浓度向样品中分别加入黄芪甲苷对照品溶液，每个加标样品平行 3 份， 按 “2.1.2.2” 项下制备供试品溶液。 分别精密吸取供试品溶液各 20 μL， 测定，计算加样回收率，结果黄芪甲苷平均回收率在98.2% ～103.3%之间， 变异系数在 0.8 ～1.6 之间，实验方法准确度良好。

2.1.9 样品测定 取不同批号的本品 3 批样品100 g，研细，取 5 g， 精密称定，按 “2.1.2.2”项下制备供试品溶液，精密吸取各批号供试品溶液20 μL， 分别注入液相色谱仪中， 测定， 批号为20120801、 20120802、20120803 的 3 批样品中黄芪甲苷的含有量分别为 126.2、 124.3 和 119.7 μg/g。

2.2 芦荟大黄素、 大黄酸、 大黄素、 大黄酚和大黄素甲醚的测定［2］

2.2.1 色谱条件 依利特 Hypersil BDSC18色谱柱（4.6 mm×200 mm， 5 μm）； 以甲醇为流动相 A，0.2%磷酸溶液为流动相 B， 进行梯度洗脱 （0 ～5 min， 28%B； 5 ～20 min， 28% ～8%B； 20 ～25 min， 8% ～28%B； 25 ～28 min， 28%B）；体积流量 1.0 mL/min， 柱温 25 ℃， 检测波长 254 nm。

2.2.2 溶液的制备

2.2.2.1 对照品溶液 取芦荟大黄素、 大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚对照品适量，精密称定，加甲醇制成每 1 mL含芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、 大黄酚、 大黄素甲醚各 0.206 mg、 0.252 mg、 0.484 mg、 0.272 mg和 0.053 6 mg的溶液；分别精密量取上述对照品溶液适量， 置于同一10 mL量瓶中， 加甲醇至刻度，混匀， 即得 （每1 mL中含芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚分别为 5.15 μg、 5.04 μg、 9.68 μg、 27.2 μg、2.68 μg）。

2.2.2.2 供试品溶液 取装量差异项下的本品，研细， 取1 g， 精密称定， 置锥形瓶中， 精密加入甲醇25 m L， 称定质量， 加热回流 1 h， 放冷， 再称定质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，精密量取续滤液 5 mL， 置烧瓶中， 挥去溶剂， 加8%盐酸溶液 10 m L， 超声处理 2 min， 再加三氯甲烷 10 m L， 加热回流 1 h， 放冷， 置分液漏斗中，用少量三氯甲烷洗涤容器，并入分液漏斗中，分取三氯甲烷层，酸液再用三氯甲烷提取3次，每次10 mL， 合并三氯甲烷液， 减压回收溶剂至干， 残渣加甲醇使溶解， 转移至10 mL量瓶中， 加甲醇至刻度， 摇匀， 滤过， 取续滤液， 过 0.45 μm微孔滤膜，即得。

2.2.2.3 阴性样品溶液 按处方比例取药材， 除去大黄片， 按工艺制备阴性样品。 取阴性样品5 g，按 “2.1.2.2” 项下制备阴性供试液。

2.2.3 系统适应性试验 精密吸取阴性供试液、供试品溶液及芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚混合对照品溶液，分别注入液相色谱仪中， 记录色谱图， 见图2。 结果表明：阴性供试液色谱图中，在与芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚对照品相同保留时间处未见有相应色谱峰干扰，实验方法的专属性良好。理论板数按大黄素峰计算应不低于3 000。

图2 芦荟大黄素、 大黄酸、 大黄素、 大黄酚、大黄素甲醚 HPLC色谱图Fig.2 HPLC chromatogram s for determ ination of aloe emodin， rhein， emodin，chrysophanol and emodin methyl ether

2.2.4 线性关系考察 分别精密吸取混合对照品溶液1、 2、 4、 6、 8、 10 μL， 注入液相色谱仪中，以进样量为横坐标，峰面积为纵坐标进行线性回归， 线性方程分别为芦荟大黄素 y=4.146x-1.145， r=0.999 9； 大黄酸 y=3.123x-1.822，r=1；大黄素 y=2.782x-1.480， r=1； 大黄酚y=4.057x-0.868 5， r=1； 大 黄 素 甲 醚 y= 14.92x-1.915， r=1。 表明芦荟大黄素进样量在5.15 ～51.5 ng范围内与峰面积线性关系良好；大黄酸进样量在5.04 ～50.4 ng范围内与峰面积线性关系良好； 大黄素进样量在 9.68 ～96.8 ng范围内与峰面积线性关系良好； 大黄酚进样量在 27.2 ～272 ng范围内与峰面积线性关系良好；大黄素甲醚进样量在 2.68 ～26.8 ng范围内与峰面积线性关系良好。

2.2.5 精密度试验 精密吸取混合对照品溶液 5 μL， 平行 6 次，注入液相色谱仪中， 测定， 芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚对照品 溶 液 峰 面 积 的 RSD 分 别 为 0.8%、 0.7%、0.6%、 0.5%和0.3%， 精密度结果良好。

2.2.6 稳定性试验 取同一供试品溶液，分别在放置0、 3、 6、 12、 18 h 时，注入液相色谱仪中， 测定，计算， RSD分别为 2.8%、 1.9%、 1.5%、 2.9%和2.4%， 说明供试品溶液在18 h 内基本稳定。

2.2.7 重复性试验 取批号为20120801 的样品50 g， 研 细， 取 1 g， 平 行 6 份， 精 密 称 定， 按“2.2.2.2” 项下方法制备供试品溶液， 分别精密吸取供试品溶液 20 μL， 注入液相色谱仪中， 测定，计算，结果6份样品中芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚含有量均值分别为50.97、 59.12、 92.84、257.9 和 13.86 μg/g， RSD分别为 2.7%、 2.3%、 2.0%、 1.6%和 2.5%。

2.2.8 加样回收试验 取批号为 20120801 的本品50 g， 研细， 取0.5 g， 平行9 份， 分3 种浓度向样品中分别加入芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚对照品溶液，每个加标样品平行3份， 按 “2.2.2.2” 项下制备供试品溶液。 分别精密吸取供试品溶液各 20 μL， 测定， 计算加样回收率，结果芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚的平均回收率 （n=9） 分别在95.6% ～104.5% 之 间， RSD在 0.2% ～2.6% 之间。实验方法准确度良好。

2.2.9 样品测定 取不同批号的本品 3 批样品 50 g， 研细， 取 1 g， 精密称定， 按 “2.2.2.2” 项下制备供试品溶液， 精密吸取各批号供试品溶液 20 μL，分别注入液相色谱仪中，测定， 实验结果见表1。

3 讨论

黄芪是本品君药，临床和实验研究表明，黄芪皂苷具有免疫调节［3］、 抗肿瘤［4］和改善心血管疾病等 广 泛 的 生 物 活 性［5-6］， 是 本 品 的 有 效 成 分。《中国药典》2010 年版一部黄芪药材项下采用蒸发光散射法，建立了其含量测定方法。参照此方法，在样品的提取过程中，本实验采用正交设计对黄芪甲苷的供试液制备进行考察，通过比较，确定应用甲醇为提取溶剂，索式提取法，水饱和正丁醇振摇提取4次，效果较好。

表1 样品中芦荟大黄素、 大黄酸、 大黄素、 大黄酚和大黄素甲醚测定结果 （μg·g-1）Tab.1 Con tent determ ination of aloe emodin， rhein， em odin， chrysophanol and emodin methyl ether in sam p les（ μg·g-1）

大黄药材的主要成分是大黄素等蒽醌类化合物，各种动物实验证明，大黄能缩短凝血时间，降低毛细血管通透性，改善血管脆性，使纤维蛋白原增加，降低抗凝血酶Ⅲ的活性，使血管收缩活动增加， 促进骨髓制造血小板， 因而促进血液凝固［7］。大黄还可以影响微循环，促进局部止血。止血有效成分是大黄酚、 大黄素甲醚等［8］。因此， 本实验采用高效液相色谱法，对紫癜颗粒中芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚定量测定方法进行了研究。结果表明：精密度、重复性及回收率实验均符合要求。

［1］ 李 爽，贾 媛，范 玲，等.芪葵颗粒定性定量方法研究［ J］.药物分析杂志， 2012， 32（9） ： 1564-1569.

［ 2 ］ 国家药典委员会.中华人民共和国药典： 2010 年版一部［S］.北京： 中国医药科技出版社， 2010： 22.

［3］ 王庭欣，王庭祥，吴广臣，等.黄芪多糖增强小鼠免疫功能的实验研究［J］.时珍国医国药， 2009， 20（7）： 1763-1764.

［4］ 杨 璐， 沈 洪.黄芪及其主要成分抗肿瘤免疫机制研究进展［J］.山东中医药大学学报， 2011， 35（3）： 281-283.

［ 5 ］ 霍根红.黄芪心血管药理作用研究进展［J］.河南中医学院学报， 2007， 22（1）： 86-88.

［ 6 ］ 郭 伟.中药黄芪的药理及临床研究概况［J］.山西中医，2011， 27（11）： 52-54.

［7］ 林声在，张朝凤，刘晓东，等.大黄、 虎杖、何首乌止血作用的比较研究 ［J］.西北药学杂 志， 2012， 27 （6）：553-555.

［ 8 ］ 李 敏， 李丽霞， 刘 渝， 等.大黄研究进展［J］.世界科学技术-中医药现代化， 2006， 8（4）： 34-39.

Quantitative determ ination for efficient fractions of Zidian Granules

ZHANG Ying*， WANG Guang-han， ZHAO Yue， WU Yi， ZOU Gui-xin
（Liaoning Provincial Academy of Chinese Medicine， Shenyang 110034， China）

purpura； astragloside； aloe emodin； rhein；emodin； chrysophanol； emodin methyl ether

R927.2

： A

： 1001-1528（2014）03-0547-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2014.03.021

2013-04-19

国家科技重大专项课题 （2010ZX09401-304）

张 颖 （1979—） ， 女， 副研究员， 博士， 从事中药药效物质基础及质量评价研究。 E-mail： xuanxuanzy@163.com