牛黄及安宫牛黄丸中游离胆红素的 RP-HPLC测定方法改进

曹 帅， 夏 晶， 钟吉强， 季 申

（上海市食品药品检验所， 上海 201203）

牛黄及安宫牛黄丸中游离胆红素的 RP-HPLC测定方法改进

曹 帅， 夏 晶， 钟吉强， 季 申*

（上海市食品药品检验所， 上海 201203）

目的 改进 RP-HPLC法测定牛黄及安宫牛黄丸中的游离胆红素以保证牛黄类药材及安宫牛黄丸的质量与用药安全。 方法 以二氯甲烷为溶剂提取样品， HPLC法测定游离胆红素的量。 对于安宫牛黄丸， 分别考察碳酸钙、硅藻土等不同分散介质对游离胆红素测定的 影响。 色谱条件为 Kromasil 100ÅC18色 谱柱 （ 5 μm， 0.46 cm×15 cm） ， 以乙腈-1%冰醋酸 （95 ∶5） 为流动相， 检测波长为 450 nm。 结果 胆红素在 0.305 5 ～30.55 μg/m L范围内线性良好， 加样回收率在 95% ～105%之间。 对于安宫牛黄丸， 采用碳酸钙作为分散介质的测定结果优于硅藻土等介质。结论 采用碳酸钙替代硅藻土作为牛黄类药材及其大蜜丸样品中游离胆红素分析的分散介质，方法准确度高，操作简便易行。

牛黄；安宫牛黄丸；游离胆红素；碳酸钙

牛黄是传统的名贵中药材，因药源稀缺，陆续出现了人工牛黄、培植牛黄和体外培育牛黄3种代用品［1］。 牛 黄 类药材及其 中 成药临床应 用 广 泛，其中有38个品种及同系列品种， 国家明令禁止使用人工牛黄投料［2］， 主要原因为人工牛黄与其他 3种牛黄有本质的区别：人工牛黄中仅含游离胆红素，而其他3种牛黄中主要含结合胆红素和共价胆红素，游离胆红素为限量成分。游离胆红素脂溶性强，可穿过人体的血脑屏障，具有神经毒性，其在牛黄类药材及制剂中含有量过高会对人体产生直接的毒副作用［3-4］， 因此需 建立牛黄类药材及 其制剂中游离胆红素的定量测定方法，对其含有量范围进行监测控制， 保证临床用药的安全［5］。

牛黄及其代用品收载于历年 《中国药典》 及增补本中，除人工牛黄外，其余牛黄均采用紫外-可见分光光度法检查游离胆红素的含有量限量［6］，由于该法测定的是胆红素四吡咯环母核结构，在制剂中应用易受其他药味干扰。目前文献报道的游离胆红素测定多集中 于牛黄类药材［7-8］， 制剂 中报道较少，由于制剂中无较好的方法控制游离胆红素的量，导致牛黄类制剂中存在游离胆红素代替牛黄类药材投料的现象，易造成该类药物的安全隐患。本研究鉴于此种现象建立牛黄类药材及安宫牛黄丸中游离胆红素的 HPLC定量测定方法。

本次研究除培植牛黄因市场上少见未能收集到样品外，其余3种牛黄均建立了方法。安宫牛黄丸是临床上常用的含牛黄制剂，因此一并建立了其游离胆红素的定量测定方法。

1 实验部分

1.1 仪器、 试剂与材料

1.1.1 仪器 Agilent1100 液相色谱仪 （ 美国 Agilent公司）； 超声波清洗仪 （上海科导超声仪器有限公司 SK8210LHC）； 离心机 （Eppendorf5430R）；旋涡混合器 （IKA MS2）。

1.1.2 试剂 胆红素对照品 （中国药品生物制品检定所提 供， 批号 10077-200503 ）； 乙腈 为色谱纯，二氯甲烷、碳酸钙等其余试剂均为分析纯，购自上海凌峰化学试剂有限公司。

样品收集情况见表1。

表1 样品收集情况Tab.1 Sample list

1.2 色谱条件 Kromasil 100ÅC18色谱柱 （5 μm，0.46 cm ×15 cm） ； 流 动 相 为 乙 腈-1% 冰 醋 酸（95 ∶5） 等度洗脱； 检测波长 450 nm； 柱温 30℃； 体积流量 1.0 mL/min； 进样量 5 μL。

1.3 样品处理与溶液制备

1.3.1 牛黄类药材

1.3.1.1 对照品溶液的制备 取胆红素对照品适量， 精密称定， 加二氯甲烷制成每 1 mL各含 10 μg、5 μg、3 μg的溶液， 分别用于人工牛黄、 体外培育牛黄、天然牛黄中游离胆红素的定量测定。

1.3.1.2 供试品溶液的制备 分别取牛黄类药材适量， 研成极细粉， 取约 20 mg， 精密称定， 置具塞锥形瓶中，涡旋混匀，精密加入水饱和二氯甲烷10 mL， 称定质量， 涡旋混匀， 置冰浴中超声处理（功率 500 W， 频率 53 kHz） 30 min， 再称定质量，用水饱和二氯甲烷补足减失的质量，摇匀，离心，取二氯甲烷液， 用微孔滤膜 （0.22 μm） 滤过，取续滤液，即得。

1.3.2 安宫牛黄丸

1.3.2.1 对照品溶液的制备 取胆红素对照品适量， 精密称定， 加二氯甲烷制成每 1 mL含1～3 μg的溶液，用于含牛黄类中成药中游离胆红素的测定。

1.3.2.2 供试品溶液的制备 取安宫牛黄丸样品适量，加入适量的无水碳酸钙，混合均匀后充分研磨， 取样品粉末60 mg，精密称定， 置具塞锥形瓶中， 精密加入二氯甲烷 20 mL， 称定质量， 涡旋混匀， 冰浴中超声处理 （功率 500 W， 频率 53 kHz）30 min，再称定质量，用二氯甲烷补足减失的质量，摇匀，离心，取二氯甲烷液，用微孔滤膜（0.22 μm） 滤过， 取续滤液， 即得。

2 结果与讨论

2.1 实验条件考察

2.1.1 影响游离胆红素测定的关键因素分析 人工牛黄中的胆红素仅为游离胆红素，除人工牛黄外，其他3种牛黄中的胆红素有游离胆红素、胆红素钙、胆红素酯、胆红素蛋白聚合物等多种存在形式［9］。若要准确测定样品中的游离胆红素，需保证在样品前处理及测定过程中胆红素钙、酯等分解成游离胆红素。另外，由于游离胆红素不稳定，易被氧化，测定中应注意避光操作，避免引入破坏氧化游离胆红素分子的因素。

2.1.2 安宫牛黄丸样品分散介质的考察 牛黄类药材质轻，松脆，易研磨成粉，样品取样相对容易。安宫牛黄丸为大蜜丸，含大量炼蜜，其存在会影响样品准确取样，因此测定前需对样品进行研磨分散。理想的分散介质应能够通过研磨等方式将样品分散均匀，且不会导致胆红素钙、酯等分解成游离胆红素，同时不破坏游离胆红素的结构。

硅藻土为常用的蜜丸分散剂， β-环糊精也有文献报道［10］， 考虑到牛黄中的胆红素多与钙离子结合，本研究选取了灰色硅藻土、白色硅藻土、β-环糊精、 碳酸钙 4 种分散介质， 分别考察其游离胆红素的测得量，并加入适量的胆红素对照品溶液，考察各样品游离胆红素的加样回收率，结果见表2。

表 2 不同分散介质的回收率 （n=6）Tab.2 Recovery of differen t dispersion medium（ n=6）

结果表明，硅藻土为分散介质的回收率偏高，β-环糊精偏低， 加 CaCO3研磨测得的游离胆红素含有量较低且回收率较好。分析其原因为，硅藻土为一种生物成因的硅质沉积岩［11］， 其中成分复杂，以非晶质二氧化硅为主， 但含有 Al2O3、 P2O5、 有机质等杂质，且杂质越多，颜色越深。硅藻土中的复杂成分可能会将部分结合或共价胆红素分解转变成游离胆红素［12］， 导致测得量增加。 另外硅藻土中的复杂成分增加了试验中的不可控因素，导致回收率试验 RSD结果偏高。 β-环糊精与样品研磨分散较好，但其回收率试验结果偏低，分析其可能的原因如下： β-环糊精中含有的多羟基结构可能会与游离胆红素中的羧酸基团形成分子间氢键［13］， 破坏了能保持游离胆红素自身稳定的分子内氢键结构［14］（ 分子内氢键结构见图 1 ） ， 使其稳 定性降低，加剧了游离胆红素的分解，导致回收率偏低，具体的作用机制有待于进一步探索研究。

试验用 CaCO3为分析纯， 含杂质较少，与样品研磨分散性好，钙离子为牛黄中本身含有的离子，酸性 较 弱 不 足 以 使 结 合或 共 价 胆红 素 分解。碳酸钙在二氯甲烷中性质稳定，试验回收率较好，是理想的样品分散介质。

图1 游离胆红素分子内氢键Fig.1 Intramolecular hydrogen bonding of bilirubin

2.2 方法验证参数

2.2.1 专属性试验 供试品色谱中， 均具与胆红素对照品保留时间一致的色谱峰，无其他成分干扰。安宫牛黄丸等中成药空白样品 （缺牛黄） 在胆红素对照品保留时间处无色谱峰，无干扰，见图2。

图2 专属性试验Tab.2 Specificity tests

2.2.2 线性范围 精密称取胆红素对照品适量，加二氯甲烷配制成系列质量浓度的对照品溶液液。取系列质量浓度的对照品溶液各 5 μL， 注入液相色谱仪，记录峰面积，以对照品溶液的质量浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。结果表明， 在 0.305 5 ～30.55 μg/mL范围内， 胆红素对照品溶液的质量浓度与峰面积呈良好的线性关系，线性相关系数为 0.999 7。

2.2.3 加样回收率试验 分别取牛黄类药材， 精密加入适量胆红素对照品，按供试品溶液的制备方法制备和测定。对于安宫牛黄丸中游离胆红素的回收率试验，取不含牛黄类药材的空白样品，精密加入适量胆红素对照品 （对照品加入量分别为样品含有量的 80%，100%， 120%）， 按供试品溶液的制备方法制备和测定， 结果见表 3， 回收率为95% ～105%，RSD为 1% ～4%。

表 3 加样回收率试验 （n=9）Tab.3 Results of recovery tests（n=9）

2.2.4 重复性试验 分别取 3 种牛黄药材及安宫牛黄丸，按供试品溶液的制备方法制备和测定，分低、中、高3个质量浓度，每个质量浓度制备3份供试品溶液进行测定， 结果见表4。

表4 重复性试验Tab.4 Results of precision tests

2.3 实际样品的测定

2.3.1 样品测定结果 对收集到的样品分别按正文供试品溶液的制备方法制备和测定，结果见表5。

表5 样品测定结果Tab.5 Results of sample tests

2.3.2 结果分析与讨论

2.3.2.1 牛黄类药材中游离胆红素含有量限值的确定 《中国药典》 2010 年版一部 “牛黄”、 “体外培育牛黄”质量标准中均制订了游离胆红素的检查项［6］， 将 10 mg牛黄或体外培育牛黄溶于 50 m L或5 m L三氯甲烷中， 紫外-可见分光光度法453 nm下测得的吸光度值不得过 0.70。 本实验参考上述检查方法，通过实验配制系列质量浓度的胆红素对照品溶液，采用紫外分光光度法测定溶液的吸光度，根据溶液的质量浓度及吸光度值绘制相应的标准曲线， 计算吸光度为 0.70 时的胆红素溶液质量浓度为 6.865 μg/m L， 以此计算牛黄、 体外培育牛黄中 游 离 胆 红 素 的 限 量 值 分 别 为 3.43% 和0.343%。 样品的测定结果显示， 体外培育牛黄及天然牛黄样品中游离胆红素的含有量在 0.168% ～0.867%， 符合药典规定的要求。

2.3.2.2 安宫牛黄丸中游离胆红素含有量限值的确定 由于体外培育牛黄的生产周期 （1～2周）远远短于天然牛黄，其中胆红素与其他物质成分结合的紧密程度也较天然牛黄小［15］， 因此在制剂中，受处方中其他药味的影响，含体外培育牛黄的中药制剂中游离胆红素量可能并不低于同品种的含天然牛黄制剂。由于体外培育牛黄为天然牛黄的替代使用品，其质量趋近于天然牛黄，故参考天然牛黄，在含牛黄中药制剂中将胆红素的限量值确定为3.43%。 安宫牛黄丸的处方为 1 000 g生药粉，制成 600 丸 （丸重为3 g/粒）， 每 1 000 g生药粉含牛黄 100 g， 以游离胆红素含有量不超过 3.43%计算，安宫牛黄丸每丸含游离胆红素含有量不得超过5.72 mg。 考虑到样品中有其他药味配伍，可能会加速牛黄中部分结合胆红素分解成游离胆红素，因此限度放宽到该限度的 115%， 即为不得过 6.58 mg。 样品的测定结果显示， 安宫牛黄丸中游离胆红素的量均未超过限值。

3 结论

本研究建立了牛黄类药材及安宫牛黄丸中游离胆红素的定量测定方法，创新性地选取无水碳酸钙为大蜜丸的分散介质，克服了传统分散介质硅藻土对游离胆红素测定的影响，准确测定了样品中游离胆红素的量。

本研究参考 《中国药典》 对牛黄类药材游离胆红素的限量规定，推算了安宫牛黄丸中游离胆红素的含有量限量，可用于安宫牛黄丸中非法掺加游离胆红素或直接以游离胆红素替代牛黄投料的检测。另外，研究改进了不同牛黄中游离胆红素的测定方法，统一了牛黄原料与制剂的方法，使结果更准确，药品质量更可控。

该方法操作简便易行，通用性较强，可为其他含牛黄类中成药中游离胆红素的测定提供借鉴参考。

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Im provem ent of unconjugated bilirubin in bezoar and Angong Niuhuang Pills by RP-HPLC

CAO Shuai， XIA Jing， ZHONG Ji-qiang， JIShen*
（Shanghai Institute for Food and Drug Control， Shanghai 201203， China）

AIM To use RP-HPLCmodification to improve themethod for unconjugated bilirubin determination in bezoar and Angong Niuhuang Pills in order to assure their quality and safety.METHODS Unconjugated bilirubin in bezoar and Angong Niuhuang Pills was eluted on a Kromasil C18column （5 μm， 0.46 cm×15 cm）by an ioscraticmobile phase composed of acetonitrile-1%acetic acid （95 ∶5） and detected at450 nm.For Angong Niuhuang Pills， different kinds of dispersion medium such as CaCO3， diatomite were investigated.RESULTS Unconjugated bilirubin was well detected in samples and its linear range was 0.305 5-30.55 μg/mL with average recoveries of 95%-105%.CONCLUSION The experiment shows thatmethod of CaCO3replacing diatomite as dispersion medium in honey bolus is easy to determine the contests of unconjugated bilirub in bezoar and Angong Niuhuang Pillswith high accuracy.

bezoar； Angong Niuhuang Pills； unconjugated bilirubin； CaCO3

R927.2， R284.1

： A

： 1001-1528（2014）03-0536-05

10.3969/j.issn.1001-1528.2014.03.019

2013-05-02

上海市科委资助项目 （12ZR1428100）

曹 帅， 硕士。 Tel： （021） 38839900， E-mail： cslucky2009@gmail.com

*通信作者： 季 申， 博士， 主任药师。 Tel： （021） 50798195