HPLC法同时测定烧伤膏中没食子酸、 芦荟大黄素、 大黄素和大黄酚

王艳坤， 赵 萍， 高 建1，*， 黄赵刚， 高昌琨， 夏 泉， 许杜娟1，*

（1.安徽医科大学药学院， 安徽 合肥 230032； 2.合肥市第一人民医院 （西区） 药剂科， 安徽 合肥230031； 3.安徽医科大学第一附属医院药学部， 国家中医药管理局中药化学三级实验室 TCM-2009-202，安徽 合肥 230022；4.安徽中医药大学药学院，安徽 合肥 230038）

HPLC法同时测定烧伤膏中没食子酸、 芦荟大黄素、 大黄素和大黄酚

王艳坤1，2， 赵 萍3，4， 高 建1，3，4*， 黄赵刚3， 高昌琨3， 夏 泉3， 许杜娟1，3*

（1.安徽医科大学药学院， 安徽 合肥 230032； 2.合肥市第一人民医院 （西区） 药剂科， 安徽 合肥230031； 3.安徽医科大学第一附属医院药学部， 国家中医药管理局中药化学三级实验室 TCM-2009-202，安徽 合肥 230022；4.安徽中医药大学药学院，安徽 合肥 230038）

目的 建立同时定量测定烧伤膏 （大黄、地榆、五倍子等） 中没食子酸、 芦荟大黄素、 大黄素及大黄酚的高效液相色谱方法。 方法 Diamonsil-C18色谱柱 （4.6 mm×250 mm， 5 μm）； 流动相为甲醇-0.1%磷酸梯度洗脱， 检测波长254 nm； 柱温 30 ℃； 体积流量 1.0mL/min。 结果 没食子酸在 0.061 1 ～0.488 5mg/mL（r=0.999 2）， 芦荟大黄素在0.008 4 ～0.067 5mg/mL（r=0.999 3）， 大黄素在 0.010 9 ～0.087 0mg/mL（r=0.999 7）， 大黄酚在 0.073 9 ～0.590 8 mg/mL（r=0.999 4） 范围内线性关系良好； 平均加样回收率分别为 98.50%、 98.15%、 97.89%及 97.52%， 其 RSD值（n=6） 分别为0.43%、 1.50%、 2.00%， 0.28%。 结论 本方法准确、 可靠、 简便， 重复性好， 适合烧伤膏中鞣质及蒽醌类物质的测定。

烧伤膏； HPLC； 没食子酸； 蒽醌类化合物

烧伤是由多种原因导致的机体复杂外伤性疾病，分为热力烧伤、 电 （流） 烧伤、 化学 （性） 烧伤和放射 （性）烧伤，临床上习惯所称的 “烫伤” 也是热力烧伤的一种［1］。 在烧伤治疗中存在着创面疼痛、 进行性坏死、 易感染、 瘢痕愈合四大难题［2］。 目前研究表明， 中药的治疗优势明显［3］。 烧伤膏是一种烧伤治疗特色制剂， 由安徽医科大学第一附属医院于上世纪七十年代研制成功，具有清热解毒、活血化瘀、涩经止血、生肌敛疮之功效，临床上适用于各种烧烫伤的治疗，经药理实验和临床实践证实效果显著［4］。 但是由于其为中药复方制剂， 成分复杂， 质量控制标准制定难度较大，因此制约了其进一步的推广使用。

烧伤膏由大黄、地榆、五倍子、炉甘石、赤石脂和冰片等药材熬制而成，其中大黄中含有的蒽醌类物质在烧伤的治疗中主要有抗菌、 消炎、 促进伤口愈合等作用［5］。 而地榆和五倍子中含有的鞣质类成分，则对伤口有很好的收敛作用，能够同创面的渗出液结痂，以防止外来细菌的有害入侵， 促进伤口愈合［6］。 所以， 为了规范该制剂的生产以及进一步的推广使用，本实验选取制剂大黄中蒽醌类成分芦荟大黄素、大黄素、大黄酚及地榆、五倍子中的鞣质类成分没食子酸为代表作为烧伤膏质量控制的量化指标，进行定量测定。

1 仪器与试剂

1.1 仪器 高效液相色谱仪 （ Waters e2695， 美国） ， Diamonsil C18（ 4.6 mm ×250 mm， 5 μm， 迪 马 科 技 公 司 ）；SB3200 超声清洗机 （必能信超声仪器公司）； 电热恒温水浴锅 （上海医疗器械五厂）； AB135-S 电子分析天平 （ 梅特勒 -托利多中国地区生产）； 低速离心机 （飞鸽牌）。

1.2 试剂 烧伤膏 （安徽医科大学第一附属医院制剂中心， 批号分别为 20130823、 20131002、 20131121）； 灭菌注射用水 （四川科伦药业股份有限公司）； 定量测定用没食子酸对照品 （ 批 号 110831-200302）、 芦荟 大 黄 素 （ 批号110795-201007） 、 大 黄 素 （ 批 号 110756-200110 ） 、 大 黄 酚（批号 110776-200615） 均来源于中国药品生物制品检定所。甲醇 （色谱纯， TEDIA公司）； 85%磷酸 （分析纯， 上海振企化学试剂有限公司）； 浓硫酸 （分析纯， 无锡市展望化工试剂 有限公 司）； 石油 醚 （分析纯， 沸程为 60 ～90 ℃， 西陇化工股份有限公司）。

2 方法与结果

2.1 色谱条 件 Diamonsil C18（4.6 mm×250 mm， 5 μm，迪马科技公司）； 流动相为甲醇 （A） -0.1%磷酸 （B） 系统梯度洗脱 （0 min， 10%A； 0 ～15min， 10% ～50%A； 15 ～30 min， 50%～85%A； 30 ～50 min， 85%A） 。 进样量 20 μL；检测波长 254 nm； 体积流量 1.0 mL/min； 柱温 30 ℃。 在此色谱条件下，理论塔板数按没食子酸、芦荟大黄素、大黄素、 大黄酚计算均不低于4 000， 分离度均大于 1.5。

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液的制备 取各对照品， 精密称定得没食子酸 9.77mg， 芦荟大黄素 1.35 mg， 大黄素 1.74 mg， 大黄酚 11.82 mg， 分别加入甲醇完全溶解后 （超声助溶），定容于 5 m L量瓶中， 制备成含没食子酸 1.954 0 mg/mL，芦荟大黄素 0.270 0mg/mL， 大黄素 0.348 0 mg/mL， 大黄酚 2.363 2 mg/mL的对照品贮备液。

2.2.2 供试品溶液的制备 取烧伤膏约 10 g， 精密称定，用甲醇提取 2 次， 每次 50 mL各超声 20 min， 过滤， 合并滤液于60 ℃下水浴， 挥干溶剂后加甲醇定容至 5 mL得溶液 A。 滤渣加 70 mL 20%硫酸， 超声 20 min 酸化后， 用石油醚提取 2 次， 分别加 70 mL、 45 m L各超声 15 min， 合并两次石油醚溶液， 于 60 ℃下挥干溶剂， 加甲醇定容至10 mL得溶液 B。 将溶液 A和溶液 B混匀后， 用0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得供试品溶液。

2.2.3 阴性对照溶液的制备 按处方及工艺制备不含大黄、 地榆与五倍子的阴性样品， 再按 “2.2.2” 项下制备成阴性对照溶液。

2.3 系统适应性考察 使用 “2.1” 项下色谱条件， 对混合对照品及样品溶液进行 HPLC分析， 通过对比样品溶液色谱图与对照品溶液色谱图，发现样品中没食子酸、芦荟大黄素、大黄素及大黄酚的保留时间与对照品一致，且分离效果良好， 如图1。

图1 样品及对照品溶液 HPLC色谱图

2.4 线性关系考察 精密量取没食子酸、 芦荟大黄素、 大黄素、 大黄酚对照品贮备液各1 mL混合并定容， 其中没食子酸 0.488 5 mg/mL； 芦荟大黄素 0.067 5 mg/mL； 大黄素0.087 0 mg/mL； 大黄酚 0.590 8 mg/mL。 将此混合对照品溶液稀释为不同质量浓度： 没食子酸 （0.488 5、 0.244 3、 0.122 1、 0.081 4、 0.061 1mg/mL）； 芦荟大黄素 （0.067 5、0.033 8、 0.016 9、 0.011 2、 0.008 4 mg/mL）； 大 黄 素（0.087 0、 0.043 5、 0.021 8、 0.014 5、 0.010 9 mg/mL）；大黄酚 （0.590 8、 0.295 4、 0.147 7、 0.098 5、 0.073 9 mg/mL）。 依次将以上对照品混合溶液在 “2.1” 项色谱条件下， 进样 20 μL， 测定峰面积， 以峰面积为纵坐标 （Y），质量浓度 （mg/mL） 为横坐标 （X）， 绘制标准曲线， 计算其回归方程及线性范围， 没食子酸为 Y=41 253 968.289 3 X-662 302.396 8 （r=0.999 2）， 线性范围为 0.061 1 ～0.488 5 mg/mL； 芦 荟 大 黄 素 为 Y=29 905 947.680 2 X-531 07.075 8 （r=0.999 3）， 线性范围为 0.008 4 ～0.067 5 mg/mL； 大 黄 素 为 Y=83 648 643.815 5 X-66 892.088 7（r=0.999 7）， 线性范围为 0.010 9 ～0.087 0 mg/mL； 大黄酚为 Y=15 070 819.028 4X-259 854.572 0 （r=0.999 4），线性范围为 0.073 9 ～0.590 8 mg/mL。 均呈现良好的线性关系。

2.5 精密度试验 精密量取供试品溶液 20 μL连续进样6次，分别测定没食子酸、芦荟大黄素、大黄素及大黄酚面积， 计算其相对标准偏差 （RSD）。 RSD值分别为 0.81%、0.99%、 0.95%和 1.34%， 结果表明， 仪器精密度良好。

2.6 稳定性试验 取供试品溶液分别在第 0、 2、 4、 6、12、 24 h 按 “2.1” 项下色谱条件进样， 测定样品中没食子酸、芦荟大黄素、大黄素及大黄酚的峰面积，计算其相对标 准 偏 差 （ RSD）。 RSD 值 分 别 为 0.87%、 1.39%、0.86%和 0.91%， 表明供试品溶液在 24 h 内稳定。

2.7 重复性试验 取同一批号 （批号 20130823） 烧伤膏样品， 按 “2.2.2” 项下平行制备 6 份供试 品溶液， 按“2.1” 项下色谱条件测定没食子酸、 芦荟大黄素、 大黄素和大黄酚的峰面积并计算其相对标准偏差 （RSD）。 RSD值分别为 1.41%、 1.73%、 2.90%、 2.28%， 均 小 于 3%，说明制剂提取方法重复性较高。

2.8 加样回收率试验 称取已知含有量的同一批次样品（批号 20130823） 约 5 g， 精密称定 6 份， 分别精密加入新配置的对照品混合溶液 5 mL， 其中没食子酸 1.30 mg， 芦荟大黄素 0.13 mg， 大黄素 0.11 mg， 大黄酚 1.20 mg。 按“2.2.2” 项下平行制备 6 份供试品溶液， 按 “2.1” 项下色谱条件测定没食子酸、芦荟大黄素、大黄素和大黄酚的峰面积并计算加样回收率， 结果如表1。

2.9 样品的测定 取烧伤膏样品 3 批次， 按 “2.2.2” 项下方法制备供试品溶液， 按 “2.1” 项下色谱条件进行测定并计算，具体结果见表2。

3 讨论

3.1 提取溶媒及方法的选择 本方法中 4 个指标成分的溶解性不同，其中鞣质类的没食子酸成分在极性大的溶剂中溶解性较强， 经预实验多次验证， 选用 50 mL甲醇提取率较高，而蒽醌类的芦荟大黄素、大黄素、大黄酚为脂溶性，故在预实验中采用三氯甲烷和石油醚作为提取溶剂，提取前先酸化处理，目的增加游离蒽醌含量，提高提取率。经比较发现三氯甲烷和石油醚提取率相当，故选用毒性较小的石油醚作为提取溶剂。在提取方法的选择上，参阅相关文献［7-8］比较发现其中超声提取法操作简便快速， 因无需加热，较少改变成分复杂的中药制剂的有效成分且所需试样量少、消耗溶剂较少，故选用此法。

表1 加样回收率试验结果

表 2 3 批烧伤膏样品测定结果 （mg·g-1， n=3）

3.2 流动相的选择 本实验所选择的定量指标没食子酸与蒽醌类成分中芦荟大黄素、大黄素、大黄酚极性相差较大，采用 《中国药典》［9］测定其中某一指标成分的流动相体系无法同时对此4种成分进行有效的分离测定。本色谱条件中的流动相体系是在多次预实验与文献 ［10-11］ 的基础上建立的， 采用甲醇-0.1%磷酸进行梯度洗脱， 对烧伤膏中此4种指标成分的分离度好，并能同时测定其含有量。

3.3 小结 本实验所建立的定量测定方法， 采用同一色谱条件对中药复方制剂烧伤膏中两类物质四个主要成分同时进行测定，操作简便，节约成本，能有效提高分析效率，此法可作为烧伤膏的质量控制方法。

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R927.2

： B

： 1001-1528（2014）05-1095-03

10.3969/j.issn.1001-1528.2014.05.051

2013-12-28

国家自然科学基金面上项目 （81173632）； 安徽省卫生厅中医药科研项目 （2012zy52）； 安徽省省级中医药发展专项基金特色中药制剂研发项目 （2013）； 安徽省高等教育振兴计划人才项目省学术带头人培养资助 （2013）

王艳坤 （1985—）， 女， 硕士生， 研究方向： 中药复方制剂质量控制。 Email： ahhfwyk@126.com

*通信作者： 高 建 （1976—）， 男， 博士， 副主任药师， 副教授， 硕士生导师， 研究方向： 中药复方药效物质基础、 呼吸药理学。Tel：（0551）62922423， E-mail： gaojianayfy@163.com许杜娟 （1963—）， 女， 博士， 主任药师， 副教授， 硕士生导师， 研究方向： 中药复方药效物质基础、 临床药学。 Tel：（0551）62922442， E-mail： xudujuan6365@163.com