LC-MS/MS法测定复方祖师麻提取物中 8 种成分溶出影响

陈良慧， 单进军， 谢 彤， 狄留庆*

（1.南京中医药大学 药学院， 江苏 南京 210023； 2.江苏省中药高效给药系统工程技术研究中心， 江苏 南京 210023； 3.南京中医药大学 第一临床医学院， 江苏 南京 210023）

［质 量］

LC-MS/MS法测定复方祖师麻提取物中 8 种成分溶出影响

陈良慧1，2， 单进军2，3， 谢 彤3， 狄留庆1，2*

（1.南京中医药大学 药学院， 江苏 南京 210023； 2.江苏省中药高效给药系统工程技术研究中心， 江苏 南京 210023； 3.南京中医药大学 第一临床医学院， 江苏 南京 210023）

目的 建立一种 LC-MS/MS 的分析方法同时检测复方祖师麻提取物 （祖师麻与甘草质量比 3 ∶2） 中 8 种成分（瑞香素、 西瑞香素、 7-OH香豆素、 甘草酸、 甘草苷、 异甘草苷、 甘草素和异甘草素）， 并应用此方法考察两者配伍前后活性成分提取率的变化情况。 方法 Hypersil Gold-C18色谱柱 （50 mm×2.1 mm， 1.9 μm） ， 乙腈-0.05%甲酸水梯度洗脱， 体积流量为 0.3 mL/min， 柱温为 35 ℃。 质谱条件为采用负离子模式， 以 SRM方式进行定量。 结果 甘草配伍祖师麻后， 祖师麻中 3 种活性成分 （瑞香素、 西瑞香素和 7-OH香豆素） 的量均有一定程度的增加， 其中尤以瑞香素的增加最为显著； 祖师麻降低甘草中苷类成分 （甘草酸、 甘草苷和异甘草苷） 溶出， 而对苷元 （甘草素和异甘草素）的溶出稍有提高。结论 该分析方法能快速、特异、灵敏并可重复检测祖师麻和甘草中的主要活性成分，两者配伍对8种成分提取率的影响并不相同。

祖师麻； 甘草； 配伍； 溶出度； LC-MS/MS

祖师麻为瑞香科瑞香属植物黄瑞香 Daphne giraldii Nitsche.、 陕 甘 瑞香 Daphne tangutica Maxim.或凹叶瑞香 Daphne retusa Hemsl.的茎皮和根皮，收载于 《中国药典》 1977 年版［1］。 其主要分布在四川、甘肃、陕西等地，为西部民间常用中药，具有镇痛、活血、消肿、祛风除湿之功效，俗称“打得地上爬，离不开祖师麻”，临床上常用于治疗风湿痹痛、 关节炎、类风 湿性关节痛等［2-4］， 目前已上市制剂有祖师麻片、祖师麻膏药、祖师麻注射剂、 祖师麻止痛喷雾剂 等［5-8］。 研究表明 祖师麻主要活性成分类型为香豆素和二萜类，但二萜类成分具有一定的刺激性，也是祖师麻中的毒性成分［9-12］。 甘草 为 豆 科 植 物 甘 草 Glycyrrhiza uralensis Fisch.、 光果甘草 Glycyrrhiza glabra L.或胀果甘草Glycyrrhiza inflate Batal.的根及根茎［13］， 其药理作用广泛， 具有 “协和诸药， 使之不争” 和 “解百药毒” 之功效， 素有 “国老”、 “药中之王” 等美誉［14-15］。 民间 用 药经 验 显 示， 祖 师 麻与 甘 草 配 伍后具有一定的增效减毒作用，但其作用机理尚不清楚［16］。

复方祖师麻由祖师麻与甘草以质量比3∶2比例配伍组成，本课题组研究发现在该比例下复方祖师麻提取物的抗类风湿性关节炎效果较好。本实验建立了同时测定祖师麻 （香豆素） 和甘草 （黄酮和皂苷） 中的 8 种成分的 LC-MS/MS 分析方法， 并分别考察了甘草对祖师麻中活性成分及祖师麻对甘草中活性成分提取率的影响。

1 仪器与试药

1.1 试剂与药品 祖师麻购自甘肃省陇南市礼县药材公司；甘草购自安徽省万生中药饮片有限公司。经南京中医药大学中药鉴定教研室刘圣金博士鉴定祖师麻为 瑞 香 科 植 物 黄 瑞 香 Daphne giraldii Nitsche.的干 燥茎皮； 甘草为 豆科植 物光果甘草Glycyrrhiza glabra L.的 根茎。 瑞 香素 （ daphnetin，121025），西 瑞 香 素 （ daphnoretin， 130305 ）， 7-OH香豆素 （7-hydroxycoumarin， 120927），甘草酸（glycyrrhizin， 111023）， 甘草苷 （ liquiritin， 111127），异甘草苷 （ isoliquiritin， 201010） ， 甘草素 （ liquiritigenin， 201004 ） 和 异 甘 草 素 （isoliquiritigenin，101026）均购自四川省维克奇生物技术有限公司，以上对照品经 HPLC检测， 纯度均≥98%。 甲醇、乙腈 （ 色 谱 纯， Merk， 德 国）； 甲 酸 （ 色 谱 纯，ROE，美国）； 水为超纯水， 其他试剂均为分析纯。

1.2 仪器 TSQ Vantage型串联三重四级杆质谱仪（美国 Thermo Fisher公司） ， UltiMate 3000 型超高效液相色谱 （美国 Thermo Fisher公司）， CPA225D型电子 天 平 （德 国 Sartorius公 司 ），Allegra 64R centrifuge型离心机 （ 美国 Beckman Coulter公司），KQ-500B型超声波清洗器 （昆山市超声仪器有限公司）， Millipore Synergy型超纯水系统 （德国 Merck 公司）。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 Hypersil Gold-C18色谱柱 （50mm× 2.1 mm， 1.9 μm）；流动相为乙腈-0.05%甲酸水溶液梯度洗脱， 0 ～1 min （10%乙腈）， 1 ～5 min（10% ～90%乙腈）， 5 ～6 min （90% ～100% 乙腈）， 6 ～8 min （100%乙腈） ， 8 ～9 min （100% ～10%乙腈）， 9 ～10 min （10%乙腈）；体积流量0.3 mL/min； 柱温 35 ℃； 进样量 3 μL。

2.2 质谱条件 ESI离子源， 选择反应监测（SRM）， 负离子模式扫描， 气化管温度 450 ℃，鞘气压力 45 Arb， 辅气压力 25 Arb， 毛细管温度350 ℃， 碰 撞 压 力 1.5 mTorr， 喷 雾 电 压 负 离 子3 000 eV； 各化合物的具体参数见表 1， 各对照品的提取离子流图见图1。

表1 质谱条件Tab.1 MS conditions

2.3 药液的制备 分别称取祖师麻、 甘草、 祖师麻-甘草药材各 3 份， 加 10 倍量的水，浸泡 0.5 h后， 煎煮2 h， 再加5 倍量水煎煮1 h，合并两次滤液， 浓缩定容至 1 000 mL，分别获得生药量为162 mg/mL的祖师麻水提液、 108 mg/mL的甘草水提液、 270 mg/mL的祖师麻-甘草水提液。

2.4 供试品溶液的制备 精密吸取上述各药液2 mL， 加水定容至 100 mL量瓶中， 摇匀。 再精密吸取稀释后的各药液5 m L， 加入5 mL甲醇， 涡旋3 min， 16 000 r/min 离心 10 min 吸取 10 μL上清液， 再加入 90 μL的 初始流动相， 涡旋 1 min，16 000 r/min离心 10 min， 3 μL进样。

图1 各成分的提取离子流图谱Fig.1 Extracted ion chromatogram s of the anlaytes

2.5 对照品溶液的制备 分别精密称取瑞香素、西瑞香素、 7-OH香豆素、 甘草苷、 甘草素、 异甘草苷、 异甘草素和甘草酸的对照品5 mg， 加500 μL的 DMSO， 超声溶解后， 再加甲醇稀释并定容至5 mL量瓶中，得到质量浓度为 1 mg/mL的对照品贮备液。

2.6 方法学考察

2.6.1 线性关系考察 采用倍半稀释法配制成不同质量浓度的混合对照品系列溶液，每个质量浓度平行 3 份。 吸取 10 μL对照品系列溶液， 再加 90 μL流动相稀释混匀， 16 000 r/min 离心 10 min 后取上清液进样，进样体积为 3 μL。以对照品质量浓度（ng/mL） 为横坐标 （X）， 对照品峰面积为纵坐标（Y） 作图， 经回归分析， 线性关系结果见表2。

表2 线性关系结果Tab.2 Result of linearity correlation

2.6.2 精密度试验 精密吸取混合对照品溶液10 μL， 再加 90 μL流动相稀释混匀， 16 000 r/min离心 10 min 后取上清进样，进样体积为 3 μL，重复进样 6 次。 测得的瑞香素、 西瑞香素、 7-OH香豆素、甘草酸、甘草苷、异甘草苷、甘草素和异甘草素的 RSD分别为 2.0%、 2.6%、 2.0%、2.4%、1.8%、 2.3%、 1.5% 和 1.4%， 均 小 于 3.0%，结果表明本实验所使用的仪器精密度良好。

2.6.3 稳定性试验 精密吸取同一供试品溶液，室温条件下放置， 按照样品测定方法于 0、 2、 4、8、12 h 后进样， 计算得到瑞香素、西瑞香素、7-OH香豆素、甘草酸、甘草苷、异甘草苷、甘草素和 异 甘 草 素 的 RSD分 别 为 2.3%、 3.0%、2.8%、 2.6%、 1.8%、 2.6%、 3.8% 和 3.2%，均小于 4.0%； 说明供试品溶液在室温下 12 h 内稳定。

2.6.4 重复性试验 精密吸取 6 份祖师麻-甘草水提液， 按 “2.4” 项中的供试品溶液的制备方法，平行处理， 并按 “2.1” 项和 “2.2” 项中的色谱和质谱条件进行测定，计算瑞香素、西瑞香素、7-OH香豆素、 甘草酸、 甘草苷、 异甘草苷、 甘草素 和 异 甘 草 素 的 RSD 分 别 为 2.6%、 4.0%、2.7%、 4.6%、 2.7%、 4.1%、 2.0% 和 3.9%，均小于5.0%； 结果表明该方法重复性良好。

2.6.5 加样回收率试验 精密吸取1mL已知质量浓度的祖师麻-甘草水提液 6 份， 分别加入一定量的混合对照品溶液， 按 “2.4” 项中的供试品溶液的制备方法，平行处理； 并按 “2.1”项和 “2.2”项中的色谱和质谱条件进行测定，计算回收率，结果见表3。

表 3 加样回收率测定结果 （n=6）Tab.3 Results of recovery tests（n=6）

2.7 样品测定 按 “2.3” 项步骤制备供试品溶液，进行测定，计算配伍前后水提液中各成分的量，结果见表4。

表 4 配伍前后活性成分的测定结果 （μg·m L-1， n=3）Tab.4 Concentrations of analytes after com patibility（μg·m L-1， n=3）

结果显示，祖师麻中3种香豆素类成分含有量的顺序是： 瑞香素 ＞西瑞香素 ＞7-OH香豆素。 与祖师麻水提液相比， 祖师麻-甘草水提液中 3 种香豆素类成分均有一定程度的增加， 除 7-OH香豆素的量没有明显增加外，其余2种成分分别增加了8.2%和15.3%， 其中西瑞香素的含有量变化有显著性差异 （P＜0.05）； 而瑞香素的含有量变化有极显著性差异 （P＜0.01）。

甘草中各成分含有量的顺序为：甘草酸＞甘草苷＞异甘草苷 ＞甘草素 ＞异甘草素。 与甘草水提液相比， 祖师麻-甘草水提液中甘草酸、 甘草苷和异甘草苷均降低， 分别降低了 15.7%、 10.4%和14.4%， 且都存在极显著性差异 （P＜0.01）； 而甘草素和异甘草素分别增加了 19.3%和 3.1%，其中甘草素的含有量变化有极显著性差异 （P＜0.01）。

3 讨论

本实验建立了一种高效液相色谱-串联质谱联用的分析方法，经过考察与验证，该方法能快速、特异、灵敏并可同时检测祖师麻和甘草中的8种主要活性成分，并成功应用于两者配伍前后活性成分提取率变化的考察，为探索其配伍机制提供有力的实验依据。

本实验比较了祖师麻与甘草配伍前后主要活性成分含有量的差异，结果发现祖师麻与甘草配伍后， 祖师麻中的3种香豆素类成分 （瑞香素、 西瑞香素和 7-OH香豆素） 的量均增加， 其中瑞香素的量增加最为显著；而甘草中的3种苷类成分（甘草酸、 甘草苷和异甘草苷） 均降低， 2种苷元（甘草素和异甘草素） 的量却有所增加。 这一结果说明甘草能提高祖师麻中主要活性成分的提取率；而祖师麻中的某些成分促进了甘草中苷类成分的水解。已有文献报道，甘草对葛根素和黄芩苷有增溶作用，并推测甘草中起增溶作用的是其皂苷类成分甘草酸［17］。 上述现象说明中药配伍并非成分间的简单叠加，而是通过相互影响，重新组合成一个整体，再发挥药效。本实验考察了配伍对各个成分提取率的影响，但其配伍机制还需进一步的探讨研究。

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Influence of Zushima combined with Gancao on dissolution of their eight components by LC-MS/MS

CHEN Liang-hui1，2， SHAN Jin-jun2，3， XIE Tong3， DILiu-qing1，2*
（1.Collegeof Pharmacy， Nanjing University of ChineseMedicine， Nanjing 210023， China； 2.Jiangsu Provincial Engineering Research Center for Efficient Delivery System of TCM， Nanjing 210023， China； 3.The First Medicine College， Nanjing University of Chinese Medicine， Nanjing 210023， China）

AIM To use LC-MS/MSmethod to simultaneously analyse eight active components（ daphnetin，daphnoretin， 7-hydroxycoumarin， glycyrrhizin，liquiritin， isoliquiritin，liquiritigenin and isoliquiritigenin）extracted from combination of Zushima（Daphne giraldii Nitsche.） and Gancao（Glycyrrhizae Radix et Rhizoma） （ ratio of 3 ∶2） and their mutual solubility.METHODS The analytes were seperated by Hypersil Gold-C18（50 mm×2.1 mm，1.9 μm） at35 ℃ and acetonitrile-0.05%formic acid used as themobile phase with gradientelution on the rate of 0.3 mL/min.A negative ionization selective reaction monitoringmodel and electrospray ionization source was applied to the analysismethod.RESULTS The separption efficient peaks presented a good linearity.After Zushima combined with Gancao， the concentrationsof three components in Zushima（ daphnetin， daphnoretin and 7-hydroxycoumarin） increased to some extent， especially for daphnetin.The concentrations of glycosides（ glycyrrhizin， liquiritin and isoliquiritin）in Gancao decreased while thatof aglycones（ liquiritigenin and isoliquiritigenin） increased.CONCLUSION Themethod is rapid， simple and accurate， which can be used to simultaneously detect the concentrations of the main components in Zushima and Gancao， and the influence of compatibility on their extraction rates is not the same.

Zushima（ Daphne giraldii Nitsche）；Gancao（Glycyrrhizae Radix et Rhizoma ） ；combination；dissolution； LC-MS/MS

R927.2

： A

： 1001-1528（2014）05-0965-05

10.3969/j.issn.1001-1528.2014.05.018

2013-10-12

国家自然科学基金 （81273655）； 江苏省高校科技成果产业化推进项目 （JHB2012-19）

陈良慧 （1988—） ， 女， 硕士生， 研究方向： 中药生物药剂学。 Tel： 15952022917， E-mail： chenlhnow@126.com

*通信作者： 狄留庆， 教授， 博士， 研究方向： 中药制剂新型给药系统。 Tel： （025） 85811071， E-mail： diliuqing928@163.com