HCV抗体ELISA检测假阳性分析

张力　张文娟

[摘要] 目的 探讨HCV抗体ELISA检测1

[关键词] 丙型肝炎病毒；抗体；酶联免疫法

[中图分类号] R156.3 [文献标识码] B [文章编号] 2095-0616（2014）03-114-04

现临床丙型肝炎病毒（HCV）感染初步诊断一般依赖于抗体检测结果，检测方法一般为酶联免疫吸附法[1]，ELISA法经过多年的发展，灵敏度高、特异性强，在临床中得到了普遍的应用。但是该法存在假阳性情况，且丙肝治疗主要用干扰素、利巴韦林等药物[2]，如若误诊会加重患者负担，导致医疗纠纷。本文探讨当检测结果1

1 材料与方法

1.1 一般资料

2012年1月～2013年9月时间段内在患者知情同意情况下筛选滨州医学院附属医院内HCV抗体ELISA首次检测1

1.2 方法与试剂

1.2.1 标本采集 清晨空腹采集血液标本3mL，真空负压式抽血针注入BD公司兔脑粉分离胶-促凝管，采集完毕后37℃水浴箱温育30min，放入离心机内3000rpm/min离心5min，确认血清与红细胞分层清晰，无溶血，无纤维蛋白残留。

1.2.2 仪器和试剂 亚特斯ADALTIS Nexgen Four全自动酶免疫分析仪；HCV Ab定性试剂为北京科卫（第三代）ELISA试剂盒。

1.2.3 步骤 所有检测由经过培训的工作人员严格遵循厂家操作程序说明和SOP，同时每次操作均同时进行室内质控测定，确保每次实验处于在控状态，同时参加卫生部临检中心室间质量评价确保结果合格。严格按照《2010版中国药典》酶联免疫法步骤进行操作，操作前将保存于2～8℃冰箱内的试剂取出放至室温环境下30min，微孔板设空白对照1孔+阳性对照2孔+阴性对照3孔+标准物质1孔，每孔为样品稀释液100μL，阳性对照、阴性对照、标准物质或待测标本10μL。用去离子水按1∶20使用50mL浓缩洗液配置洗涤液。实验在NEXGEN FOUR内根据预设程序进行，加入样本后反应时间60min，洗板加酶后反应时间30min，加入显色剂A、B液后反应时间30min。

实验结束后NEXGEN FOUR使用空白孔校零双波长450nm/620nm下读取各孔OD值，然后将将结果传输至康金软件进行判读。

1.2.4 判断标准 所有标本使用科卫试剂分3次进行检验，取3次S/CO均值。1≤S/CO判断为有反应性（R），1>S/CO判断为阴性（N）。

1.3 统计学方法

统计分析采用SPSS19.0软件，数据以（）表示，计量资料采用t检验，计数资料采用x2检验，P<0.05为差异有统计学意义，P<0.001为差异有高度统计学意义。

2 结果

对HCV抗体ELISA首次检测1

对比人群正常体检人群首次检测HCV抗体阴性20例，2～6个月内再次检测仍全为阴性。将首次检测和2～6个月再次检测结果分为两组，选择四格表x2检验，总例数n≥40且所有格子的t≥5，x2=27.219，P<0.01两组数据有显著性差异。

3 讨论

丙肝起病隐匿[4]，由于HCV包膜糖蛋白的高变异性以及体外细胞培养模型缺乏导致丙肝有效疫苗的研制进展缓慢[5]，现尚无应用于人体的可预防丙肝病毒感染的有效疫苗[6]。但是丙肝早期可以治愈[7]，同时丙肝后期时间长用药昂贵[8]，所以要求丙型肝炎病毒（HCV）抗体检测结果应该尽量准确以便为临床治疗提供有效依据。但是通过上面46例人群ELISA检测结果可以看到，首次检测有反应性26例2～6个月之间再次检测有6例抗体检测结果转变为阴性，20例阴性人群仍为阴性，使用SPSS19.0统计软件分析后得出首次检测和2～6个月再次检测结果两组数据P<0.01，有统计学差异，所以HCV抗体检测有反应性并不能确诊丙肝，应同时加做RIBA实验[9-10]或进行HCV RNA检测[11]。根据最终确诊结果可以看出6例抗体首次检测有反应性再次检测为阴性者未感染HCV，所以如果首次检测抗体酶标法显示有反应性的话，应进行随访检测，随访结果可有效的避免首次检测导致的误导，有助于对感染状态做出准确的判断。

现跟随基因技术的进步和制作工艺的提高，丙肝初筛ELISA法经过不断的改良，经历了第一代、第二代试剂，已经发展到第三代，包被微孔板上第三代试剂抗原采用核心区C22-3抗原和及非结构基因NS3（C22）、NS4（C33c、C100-3）抗原，核心区抗原比例相对下降，NS3区C33c比例增高，加入NS5抗原，敏感性、特异性与较第一、二代试剂相比提高较大[12-13]，但是并不能排除假阳性，文献[14-16]显示HCV ELISA检测与HCV RNA等其他方法相比较存在假阳性。

分析酶联免疫吸附法假阳性原因主要有以下几点：（1）试剂因素。抗-HCV ELISA试剂盒虽经多年发展，现多采用基因工程重组丙型肝炎病毒抗原包被固相，但是仍存在抗原不纯、多克隆抗体和酶结合物纯度低等容易导致假阳性结果的影响因素[17]。（2）患者体内内源性物质干扰，如类风湿因子、高免疫球蛋白、超氧化物歧化酶等干扰因素与固相HCV抗原结合导致显色假阳性。（3）操作影响。全自动酶免分析仪可有效避免加样不准确、孵育温度波动、时间过短、人为失误等因素，但是标本溶血、细菌污染、凝固不全等因素无法避免，同时洗板针堵塞、抽吸不全或注液量不足等导致洗板不彻底的因素，都可引起假阳性。

本研究中工作人员严格按照操作规程操作，有效避免了人为错误，分析6例ELISA首次检测假阳性的原因主要有：批次试剂之间的差异性，部分批次试剂灵敏度过高或特异性较低；患者体内内源性物质干扰。

HCV-Ab酶联免疫吸附试验（ELISA）虽然操作简单、灵敏度高、特异性强，但是存在较高的假阳性情况，容易对临床造成误导。通过首次检测和2～6个月再次检测我们也可得出，虽然HCV抗体ELISA试剂存在假阳性的情况，但是若是在2～6个月内再次进行复查则可有效的排除假阳性情况。报告显示[18]全球如非洲等部分地区医疗负担较重，人均医疗水平较低，中国社科院发布报告[19]指出我国中西部和农村医疗资源与东部相比差距较大，对于这些可能无法具有RIBA实验、HCV RNA检测或发光检测的医疗条件的边远或经济不发达地区2～6个月间复查可疑HCV抗体结果比较实用。当然对于HCV抗体ELISA检测有反应性者应尽早进行HCV-RNA等测定[20]，以便帮助临床早期确切诊断丙肝。

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（收稿日期：2013-11-03）