γ-聚谷氨酸及其生物合成机制的研究进展

关阳，王国良，张国峰，贾力耕，梁颖超，吴延东

（玉米深加工国家工程研究中心，吉林长春130033）

γ－聚谷氨酸（γ－PGA）是一种聚阴离子多肽，它是由多个谷氨酸单体以γ－羧基和α－氨基经肽键的形式缩合而成，且每一个谷氨酰基都包含各自的手性中心。γ－PGA自发现以来就已然成为现代生物高分子聚合物的研究热点。有关γ－PGA的纯化和测定方法比较成熟，这为开展基因工程和生物化学等方面的研究提供了便利条件[1]。从立体构型的角度来分析，γ－PGA具有3种不同类型：γ－D－聚谷氨酸（γ－D－PGA）、γ－L－聚谷氨酸（γ－L－PGA）以及 γ－D/L－聚谷氨酸（γ－DL－PGA）。

在γ－PGA开始实际应用之前，需解决一系列的问题。首先是成本问题，尤其是在现有条件下γ－PGA的成本远远高于其它材料。其次，截至目前还不能利用有机化学方法人工合成γ－PGA。此外，还需阐明γ－PGA的生物合成机制，进而为随后的工业化生产提供理论支持。如今，我们国家正致力于构建和谐社会，发展生态经济，实现可持续发展，而“白色生物技术”功不可没，这为γ－PGA的发展提供了强大的推动力。

1 理化性质

γ－PGA具有良好的成膜性、成纤维性、阻氧性、可塑性、粘结性、吸水性以及可生物降解性等，因而具有增稠、乳化、凝胶、成膜、保温、助溶、缓释和粘结等功能[2]。γ－PGA的pKa=2.23，这与谷氨酸α－羧基的pKa值非常接近[3]。通过热重（TGA）和差示扫描量热（DSC）分析可知，其熔点为223.5℃，热分解温度为235.9℃[4]。

γ－PGA 可溶于二甲基亚砜（DMSO）、热的 N，N－二甲基甲酰胺（MSDS）、N－甲基－2－吡咯烷酮（NMP）[5]。分子量和多分散性是γ－PGA的重要特征参数，γ－PGA的聚合度在200～700之间，分子量分散性为2～5，分子量越大，其流变性越难控制，也越难被化学修饰，从而限制其应用。可采用多种方法得到不同分子量的γ－PGA，如超声波降解[6]、碱水解、微生物或酶降解[7]以及改变培养基成分[8]等。

γ-PGA易溶于水，能够形成有粘弹性的弱凝胶，但有些物理或化学手段会破坏γ-PGA形成的凝胶网络结构，甚至失去粘弹性，如长时间高温加热、酸或碱处理、金属离子等。研究表明，γ-PGA溶液属于非牛顿型（假塑性）流体，其表观粘度随剪切速率的升高而降低[9]。此外，γ-PGA平均分子量的倒数与水解时间在80、100℃和120℃下呈线性关系，说明在加热条件下，水溶液中的γ-PGA多肽链可随机断裂而发生水解[10]。

2 应用

γ-PGA的3种构型均安全无毒、可食用、可生物降解，很有潜力发展成为一种环境友好型高分子材料[11]。交联γ-PGA具有很强的持水力，可以代替非降解型水凝胶成为新一代可降解水凝胶[12]。γ-PGA在环境、农业及生物医药领域都有应用价值，包括生物可降解尿片、蓄水剂、药物或肥料的缓释剂等。其中，γ-PGA作为絮凝剂可用于污水处理以及食品和发酵工业的下游加工[13]。此外，γ-PGA在工业中的应用领域急剧扩大，可作为金属/放射性核素交联剂[11]、蛋白酶抑制剂、低温防护剂[14]、苦味减缓剂[15]、增稠剂、饲料添加剂、骨质疏松预防因子[16]、湿润剂、药物载体[17]、基因载体[18]、治疗性生物粘合剂[19]、分散剂和抗体/酶结合（固定）材料[20]。

3 生产菌株

自发现第一株生产菌Bacillus anthracis后，又相继发现古生菌、细菌和动物均能产生γ-PGA。

3.1 聚-γ-DL-谷氨酸产生菌

1913年，从日本纳豆中分离出一株枯草芽孢杆菌（B.subtilis）。在后续研究中，在纳豆粘液中发现了γ-DL-PGA[21]。

产γ-DL-PGA的芽孢杆菌可分为自产谷氨酸型和外源谷氨酸依赖型。B.subtilis 5E[15]、B.subtilis TAM-4[22]、B.licheniformis A35[23]和 B.licheniformis S173[24]等属于前者。B.subtilis IFO 3335[25]、B.subtilis subsp.Chungkookjang[21]、B.licheniformis WBL-3[26]、B.licheniformis P-104[27]等属于后者。地衣芽孢杆菌产生的γ-PGA具有立体结构多样性[28]，很可能具有两种或两种以上γ-PGA合成体系。除枯草芽孢杆菌外，Staphylococcus epidermidis的某些菌株也可以产生γ-DL-PGA以避免激发哺乳动物的免疫反应[29]。

3.2 聚-γ-D-谷氨酸产生菌

20世纪50年代，仅发现B.anthracis可以生产γ-D-PGA[30]。虽说γ-D-PGA对哺乳动物无毒害作用，但是它可以减弱宿主的免疫力甚至加重炭疽热症状[31]。

3.3 聚-γ-L-谷氨酸产生菌

从很多极端微生物体中分离得到γ-L-PGA[11]。极端嗜碱菌Bacillus halodurans[32]和 Natronococcus Occultus[33]分泌的低分子量γ-L-PGA可以中和菌体周围的碱性环境，而极端嗜盐古生菌Natrialba aegyptiaca产生的高分子量γ-L-PGA可以在高盐环境中防止菌体脱水[34]。有研究表明，Bacillus megaterium在盐的诱导下可以产生以L型为主的γ-PGA[35]。此外，γ-L-PGA还广泛分布于多种刺胞生物中，比如水螅中刺细胞分泌粘液的主要成分就是γ-L-PGA[36]。在产生γ-L-PGA的过程中，具有生物活性的阳离子如K+、Mg2+和Ca2+可以辅助调节生物体内渗透压。

4 氨基酸多聚物的非核糖体聚合模式

抗菌多肽和抗菌聚氨基酸一般具有以下特点：含有非蛋白质氨基酸（如γ-PGA中的D-谷氨酸残基）、键合独特（如γ-PGA中的γ-氨基参与成键）且修饰方式与众不同。他们通常都是非核糖体合成模式。

4.1 γ-PGA的硫模板合成机制

有研究发现，从L-谷氨酸合成γ-D-PGA的过程中需要细胞膜的辅助；反之，D-谷氨酸既不能作为底物也不充当抑制剂。这种核苷由副反应产生，比如L-谷氨酸存在下，ATP水解成AMP[37]。

以上发现有力地支持了γ-PGA的硫模板机制假说，尤其更适用于γ-D-PGA。酶中的两个巯基基团可参与催化：结合位点S1H和延伸位点S2H。首先，L-谷氨酸活化，ATP水解生成L-谷氨酰-γ-腺苷酸；然后以共价键形式连接到S1H基团上，异构成D-谷氨酸。γ-D-PGA链和S2H基团的硫酯键受到S1H位点上的D-谷氨酰的亲核攻击，进而使链得到延伸。最后，γ-DPGA链重新回到S2H位点或被终止子释放从而反应结束。虽然，B.licheniformis的基因组已被破解，但类似非核糖体肽合成酶（NRPS）的γ-PGA合成酶基因图谱尚不清楚。而一旦被获悉，人们将很可能发现一种全新的合成生物多聚氨基酸分子机制及其严格的立体结构规则。

4.2 γ-PGA的氨基连接合成机制

在B.subtilis subsp.chungkookjang中发现，合成γ-PGA需要细胞膜的辅助[38]。与 B.licheniformis ATCC9945不同，它可以同时利用D-和L-谷氨酸作为底物；而且，ATP水解后得到的是ADP而非AMP[39]。有学者研究表明，B.subtilis中的γ-DL-PGA合成酶不是类似NRPS，而是一种内含氨基连接酶的模块蛋白复合体[40]。有趣的是，B.anthracis 合成 γ-D-PGA[41]、B.licheniformis合成 γ-DL-PGA[42]、S.epidermidis合成 γ-DL-PGA[29]的酶均与B.subtilis中PGA合成酶的一级结构相类似。

上述发现均与氨基连接机制假说相一致。该假说中，在任何反应阶段γ-PGA都不以共价键的方式与细胞膜辅助的酶相连接；因此，必须有一步与胞壁质的粘合反应[43]。首先，ATP中的磷酰基转移到γ-PGA链末端的羧基上，处于活性位点的ADP得以释放。然后D-/L-谷氨酸单体对γ-PGA的磷酸化羧基进行亲核攻击，进而形成一个新氨基连接。该反应在酶活性位点上重复进行，γ-PGA链便得以延伸。在解释芽孢杆菌分泌的γ-PGA为何分子量差异较大且立体结构多样性时，氨基连接机制似乎比硫模板机制更加合理。

5 生物法合成γ-PGA的前体

毫无疑问，谷氨酸是γ-PGA的直接前体，但D-谷氨酸是否可以成为γ-D-和γ-DL-PGA的底物？正因为如此，才会出现两种截然不同的γ-PGA合成机制假说。一项关于合成含有D-谷氨酸微囊藻毒素的NRPS研究中发现，由谷氨酸消旋酶生成的D-谷氨酸可以直接进入相应的氨基酸残基位点[44]。但在硫模板机制中，L-到D-的单向异构作用是不存在的。

5.1 L-谷氨酸的生物合成

在B.subtilis中，合成代谢和分解代谢均可生成L-谷氨酸。一般而言，一个L-谷氨酸分子和一个α-酮戊二酸分子在L-谷氨酰胺合成酶和L-谷氨酸合酶的催化下得到两分子L-谷氨酸[45]。谷氨酸盐缺乏时，α-酮戊二酸和NH4+经L-谷氨酸脱氢酶催化生成L-谷氨酸。而L-天冬氨酸和α-酮戊二酸经L-天冬氨酸氨基转移酶生成草酰乙酸和L-谷氨酸。此外，谷氨酸族的外源氨基酸，如L-精氨酸和L-脯氨酸均可异化生成L-谷氨酸[15]。很可能是因为胞内过量的L-谷氨酸诱导合成γ-PGA。通过分析B.subtilis中的外源L-谷氨酸，有助于阐明外源L-谷氨酸依赖型γ-PGA的合成机制。

5.2 D-谷氨酸的生物合成

研究芽孢杆菌中D-谷氨酸的合成时，D-氨基酸转氨酶（DAT）和谷氨酸消旋酶（GLR）是非常重要的两种酶。除此之外，人们更关注两种酶活性之间的关系和γ-PGA的立体结构。一般而言，完全D-或优先合成D-的 γ-PGA 产生菌（B.anthracis和 B.licheniformis），其DAT活性较高；γ-DL-PGA产生菌（B.subtilis）具有GLR活性；完全L-或优先合成L-的γ-PGA产生菌（B.megaterium和N.aegyptiaca），其D-谷氨酸合成相关酶的活性较低或不存在[47]。

6 γ-PGA合成酶

若合成的γ-PGA分泌至胞外（分泌型），则相关基因命名为 pgs（Polyglutamate synthase）；若作为荚膜成分（结构型），其相关基因命名为 cap（Capsule）[48]。

6.1 分泌型γ-PGA合成酶

Ashiuchi等人对一株野生型B.subtilis染色体DNA中合成γ-DL-PGA的基因簇进行了鉴定，这个基因簇包含四个开放阅读框（ORF），即 pgsB、pgsC、pgsA（或 pgsAA）和 pgsE[38]。

B.subtilis中的 γ-PGA 合成酶（PgsB，Pgs-C，Pgs-A，和Pgs-E）均位于膜上，但是Pgs组分的特点是含有一些可溶解的形式。有人发现PgsB只有在L-谷氨酸存在时才会催化ATP水解，而溶解的PgsBC和PgsBCA可以在D-/L-谷氨酸存在时水解ATP。到目前为止，已鉴定出来的所有水溶性的Pgs组分都不是γ-PGA合成酶。它们仅仅是依赖谷氨酸的ATP水解酶或者是特有的酰胺连接酶，可能会合成非常短的γ-谷氨酰基肽段。目前，只有一种位于细胞膜的γ-PGA合成酶能催化合成高分子量的γ-PGA。

为了进一步了解γ-PGA生物合成的分子机制，应该对γ-PGA合成酶的结构生物学进行研究。下面总结了每种Pgs组分的结构特点和预测的功能。

通常认为PgsB是发挥催化作用的最主要组分[49]，因为它的一级结构跟那些依赖Mg/ATP的水溶性的酰胺连接酶相类似，而酰胺连接酶可以催化短的γ-L-谷酰基链形成一个叶酸基[50]。

PgsC很有可能是这种酶嵌入膜内的一种组分[11]。PgsC与N-乙酰谷氨酸合成酶的N-乙酰转移酶域结构域相似[51]。而ε-聚-L-赖氨酸合成酶在C-末端也有类似于N-乙酰转移酶的三个串联重复单元，并且所有重复单元在催化过程中都发挥着重要的作用[52]。

PgsA有膜锚定区域[11]，可以使酶固定在细胞表面[53]，在很多微生物中都可以找到类似的组分。B.subtilis中的PgsA可能在γ-PGA分泌和（或）含有D-谷氨酸的γ-PGA合成酶的翻译后修饰中发挥重要作用。

与Pgs的其他组分相比，PgsE的作用还不完全清楚。不过有研究结果显示，它可能和一种膜相关的CapE（γ-PGA合成酶结构型）在功能上相同，这种CapE在B.anthracis中以质粒为负载的γ-PGA合成体系内是一种主要成分[43]。

6.2 结构型γ-PGA合成酶

B.anthracis的荚膜中含有γ-D-PGA，其为该病原菌毒性的主要成分之一[31]。B.anthracis中包含两个质粒 pXO1（108 kb）和 pXO2（951 kb）。研究表明，在质粒pXO2上鉴定出基因簇状的三个ORF，即capB、capC和capA；它们对消除了质粒pXO2的B.anthracis突变体的荚膜恢复至关重要，并推断γ-D-PGA的合成体系是一位于膜上的多酶复合体[54]。将capBCA克隆到Escherichia coli中，表达后发现capB为重叠基因，它能够编码两种蛋白CapB和CapB′，CapBCA以膜结合蛋白形式存在；另外，在capBCA基因簇下游发现了编码γ-D-PGA降解酶的基因dep[46]。

7 结论与展望

自从γ-PGA发现以来已有整整一百年了。尽管现代遗传学的发展有助于阐明γ-PGA的产生机制，但是酶学研究仍然处于初期阶段。鉴于一些带有γ-L-/γ-D-谷氨酰胺残基相对较小的化合物是通过酰胺连接形成的，因此可以推测γ-PGA也是通过同样的途径合成的；另一方面，链延伸的过程在γ-PGA的合成中并不多见，仍需进一步阐明γ-PGA生物合成的分子机制。γ-PGA合成酶的膜关联性是否对链的延伸起着关键作用还有待研究。

塑料和水凝胶因其便利性和经济性逐渐成为一种现代工业和日常生活中的必需品，而绝大多数都来自于石油化工产品。但是不合理的利用会对环境和健康带来负面影响。因此，当今社会亟需环境友好型生物可降解大分子材料，从而有助于节约资源和能源、抑制温室效应、提高粮食产量、实现可持续发展。γ-PGA正是这样一种顺应潮流的生物高分子材料，希望γ-PGA合成机制的阐明可以帮助确立一个有效的γ-PGA生产体系，进而被以γ-PGA为原材料的制造业所采用，来生产适合未来生活方式的生态材料。

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