猪2型链球菌安徽分离株的毒力基因、溶血性及耐药性分析

焦安心，许大文，赵洪武，程 谦，郑 浩，马建华，魏建忠，孙 裴，李 郁

猪链球菌(Streptococcussuis,S.suis)是世界范围内引致猪链球菌病最主要的病原，根据荚膜多糖可将S.suis分为35个血清型，即1型～34型和1/2型，其中2型(Streptococcussuisserotype 2,S.suis2)对猪的致病性最强，在世界范围流行最广，而且是重要的人兽共患病病原菌之一[1]。

S.suis2的致病性与其携带的毒力因子密切相关，目前公认的主要毒力因子有荚膜多糖(Capsular polysaccharide，CPS)、溶菌酶释放蛋白(Muramidase-released protein，MRP)、胞外因子(Extracellular protein factor，EPF)和溶血素(Suilysin，SLY)等[2]。S.suis2毒力基因的分布具有地域性差异，不同地区S.suis2分离株可能含有不同的毒力因子，这是S.suis2不同分离株毒力不同的重要原因[3]。SLY在S.suis2侵入和裂解细胞的过程以及导致脑膜炎过程中发挥重要作用，溶血类型及溶血价常作为初步判断其致病力强弱的重要指标之一[4]。目前，由于抗生素不合理应用，S.suis2耐药现象日益严重，不同地区在抗生素的选择压力下，S.suis2的耐药表型出现了地域性差异。

本研究通过对来自兽医临床上19株S.suis2安徽分离株的毒力基因、溶血性及耐药性进行检测分析，旨在为进一步研究S.suis2 安徽分离株的致病性奠定基础，为有效防控猪链球菌病提供科学依据。

1 材料和方法

1.1受试菌株 19株S.suis2安徽分离株由安徽农业大学动物科技学院传染病研究室分离、鉴定与保存，主要来自合肥、阜阳、亳州、安庆、宿州和蚌埠等地区。

1.2质控菌株 肺炎链球菌ATCC49619 购于中国食品药品检定研究院。

1.3主要试剂 胰酪胨大豆酵母浸膏肉汤(TSB-YE)、胰酪胨大豆酵母浸膏琼脂(TSA-YE)、水解酪蛋白琼脂(M-H)购自绍兴天恒生物科技有限公司；2×TaqPCRMasterMix，DNA Marker D2000、DNA Marker I均购自北京天根生化有限公司；25种药敏纸片：氨苄西林(AMP)、阿莫西林(AMX)、头孢唑啉(CFZ)、头孢呋辛(CXM)、头孢他啶(CAZ)、新霉素(NEO)、庆大霉素(GEN)、卡那霉素(KAN)、丁胺卡那霉素(AN)、红霉素(E)、阿奇霉素(AZZ)、吉他霉素(KIT)、四环素(TET)、强力霉素(DOX)、恩 诺 沙 星 (ENR)、环丙沙星(CIP)、氧氟沙星(OFX)、克林霉素(CM)、洁霉素(LIN)、杆菌肽(BAC)、复方新诺明(SXT)、甲氧苄啶(TMP)、磺胺异恶唑 (SIZ)、氟苯尼考(FLO)、利福平(RA)均购于杭州天和微生物试剂有限公司。

1.4毒力基因检测 参考文献[5-6]分别针对cps2J、mrp、epf、sly合成引物(见表1)，特异性引物均由上海生物工程技术有限公司合成。

表1 用于扩增四种毒力因子的PCR引物

采用裂解法提取细菌DNA：挑取单菌落接种到含有5%血清的TSB中，培养24 h，取1 mL菌液加入1.5 mL离心管中，10 000 r/min 离心5 min，弃上清液，加入100 μL灭菌ddH2O混匀，置沸水中煮沸10 min，冰浴10 min，10 000 r/min离心10 min，取上清液，即为DNA模板。

PCR扩增的反应体系：总体积25 μL ，其中2×TaqPCRMasterMix12.5 μL，ddH2O 5.5 μL，上下游引物各1 μL，模板5 μL。反应条件：95 ℃ 预变性5 min；95 ℃ 变性45 s，cps2J、mrp、epf、sly退火温度及时间分别为56 ℃ 50 s、55 ℃ 1 min、60 ℃ 55 s、58 ℃ 1 min，72 ℃ 延伸1 min，扩增30个循环；72 ℃ 延伸10 min。PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测。

1.5溶血性检测

1.5.1PA法检测溶血类型 将19株S.suis2安徽分离株接种于含5%兔血的TSA平板，37 ℃培养24 h后观察菌落周围溶血状态。单菌落周围有透明溶血环的菌株判定为β溶血；单菌落周围有草绿色溶血环的菌株判定为α溶血；不发生溶血的菌株为γ溶血。

1.5.2micro-ELISA法检测溶血价 参考文献[4,7]测定菌株溶血价，将各菌株接种于含5%血清的TSB，37 ℃静止培养24 h制成种子液，取种子液按1%比例接种于含5%血清的TSB，37 ℃静止培养，接种后8 h、12 h、16 h、20 h和24 h取培养液，12 000 r/min离心5 min，取上清，10 mmol/L Tris-HCl(pH 7.8)生理盐水倍比稀释，将不同倍数稀释的上清液和等量的1%兔红细胞加入96孔板中，振荡混匀，37 ℃作用2 h，4 ℃过夜沉淀，测OD540。溶解50%红细胞的上清液的稀释倍数即为溶血价，以5个时间点中测定的最高溶血价作为该菌株的溶血价。

1.6药物敏感性检测 以肺炎链球菌ATCC49619为质控菌株，采用美国临床实验室标准化委员会推荐的Kirby-Bauer纸片琼脂扩散法及判定标准[8]。

2 结 果

2.1毒力基因检测 19株S.suis2安徽分离株cps2J、mrp、epf和sly基因的检出率分别为100%、68.4%、68.4%、89.5%，共分为7个基因型：cps2J+/mrp+/epf+/sly+、cps2J+/mrp+/epf-/sly+、cps2J+/mrp+/epf-/sly-、cps2J+/mrp-/epf+/sly+、cps2J+/mrp-/epf-/sly+、cps2J+/mrp-/epf-/sly-，其中cps2J+/mrp+/epf+/sly+所占比例达57.9%，为优势基因型(见表2)。

表2 19株S. suis 2安徽分离株毒力基因检测结果

2.2溶血性检测 在19株S.suis2安徽分离株中，13株呈α溶血，溶血价为1∶4～1∶32；6株呈β溶血，溶血价为1∶32～1∶128。其中CH1溶血价为1∶64(β溶血)，SZ2溶血价为1∶32(α溶血)，未检出sly基因。各菌株溶血类型、溶血价结果见表3。

表3 19株S. suis 2安徽分离株的溶血性

2.3药物敏感性检测 19株S.suis2安徽分离株对利福平、头孢他啶、氟苯尼考、头孢唑啉的敏感率较高，分别达到89.5%、89.5%、78.9%、78.9%，对强力霉素、四环素、杆菌肽和磺胺异恶唑的耐药率较高，分别为84.2%、84.2%、84.2%、78.9%；分离菌株普遍对氨基糖苷类抗生素耐药或中介(见表4)。19株S.suis2安徽分离株均耐3种以上抗生素，且多重耐药谱为强力霉素、四环素、杆菌肽和磺胺异恶唑，构成比为63.2%(见表5)。

3 讨 论

目前虽然对S.suis2致病机制并不十分清楚，但普遍认为其致病性强弱与其毒力基因有关。cps2J、mrp、epf、sly是S.suis2重要的毒力基因，常作为检测的靶基因，然而在不同的S.suis2分离株中，其分布特征存在着地区性差异。2009年，Verena Blume等[9]检测101株源自脑膜炎、败血症、关节炎或肺炎猪体的S.suis2，cps2J+/mrp+/epf+/sly+的菌株所占比例为33.7%；同年，Wei等[10]针对我国16个省份，检测176株源自脑膜炎、肺炎、关节炎或心内膜炎猪体的S.suis2，cps2J+/mrp+/epf+/sly+的菌株所占比例为54%。本研究中，来自临诊患病猪的19株S.suis2安徽分离株cps2J+/mrp+/epf+/sly+的菌株所占比例为57.9%，表明安徽地区猪群中S.suis2的毒力基因型与国内相关报道基本一致，而与国外的报道存在一定差异。此外，不同健康状况猪体上的S.suis2分离株中，cps2J、mrp、epf、sly的分布特征也存在差异。2000年，Florence等[2]同时对分离自患病猪和健康猪体的S.suis2进行检测，54株源自患病猪体的S.suis2，cps2J+/mrp+/epf+/sly+的菌株占35.2%，9株源自健康猪的S.suis2，cps2J+/mrp+/epf+/sly+的菌株仅占30%；2013年，纪少博等[11]检测194株源自我国不同地区健康猪上的S.suis2，cps2J+/mrp+/epf+/sly+的菌株为33.5%。从而显示cps2J、mrp、epf、sly4种毒力基因与S.suis2的致病力强弱相关。

根据链球菌在血琼脂平板上的溶血现象分为α、β和γ共3类，α-溶血性链球菌多为条件致病菌，β-溶血性链球菌致病力强，而γ-链球菌无致病性，故溶血性在鉴定链球菌的致病性方面有一定的意义。本研究中，19株S.suis2安徽分离株在兔血平板上呈现α和β两种溶血类型，表明不同S.suis2安徽分离株对兔红细胞溶血能力的差异性及其致病力的不同。链球菌溶血性的形成与其产生的SLY相关，SLY的产生量可以用溶血价来衡量。本研究中19株S.suis2，β溶血菌株的溶血价(1∶32～1∶128)高于α溶血菌株(1∶4～1∶32)，表明β溶血菌株能产生较多SLY，其毒力可能强于α溶血菌株，因为决定S.suis2毒力大小的因子是多方面的。SLY由sly基因编码，sly基因全长1 494 bp，其5′端可发生变化，从而使sly基因丧失完整性，但这种不完整性却没有改变其溶血特性，甚至不影响其毒力大小[12]。本研究中，19株S.suis2安徽分离株均具有溶血活性，但其中1株β溶血和1株α溶血菌株未检出sly基因，表明这两株S.suis2安徽分离株的sly基因发生了改变。

抗生素疗法是目前治疗猪链球菌病的重要手段，由于临床上滥用、乱用抗生素现象普遍，导致细菌耐药性增强，给该病的防治带来一定困难。本研究中，19 株S.suis2安徽分离株均为多重耐药，其中对强力霉素、四环素、杆菌肽和磺胺异恶唑的耐药率较高，分别为84.2%、84.2%、84.2%、78.9%，且对该4种抗生素的多重耐药率达63.2%，对氨基糖苷类抗生素的耐药率也较高(50%以上)，且中敏率高达42.1%，显示出向产生耐药性发展的趋势，应得到足够的重视。2005年，Vela等[13]报道，22株S.suis2法国分离株对四环素类、大环内酯类、磺胺类、林克酰胺类多重耐药率达68.2%。2010年，徐引弟等[14]对35株S.suis2河南分离株药敏试验结果显示，对复方新诺明、庆大霉素、四环素、链霉素、万古霉素、氯霉素的耐药情况严重。表明在抗生素选择的压力下，不同地区S.suis2分离株的耐药特性及多重耐药性谱存在一定的差异，因此，适时监测S.suis2的耐药性及其变化趋势，药敏试验筛选药物，合理、科学、规范用药，有利于减少和控制耐药菌株的产生，对有效防控S.suis2病具有十分重要的意义。

表4 19株S. suis 2安徽分离株的药物敏感程度分布

表5 19株S. suis 2安徽分离株多重耐药谱的分布

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