探讨小鼠肌肉组织中老化淀粉样变纤维的传播性

霍 佳，钱俊乔，李陈莉，樋口京一，郭浅妤，钱金泽

淀粉样变性是一组由蛋白错误折叠引起的，以淀粉样蛋白纤维沉积于各种组织间质为特征的，引发多系统损伤的全身性疾病。目前，已发现28种不同的前体蛋白可在活体中形成淀粉样蛋白，并伴随正常组织结构和功能的破坏，导致相应器官功能障碍而引起的一系列病理改变，如朊病毒病(prion diseases)、阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease)、II型糖尿病、家族性淀粉样多神经病(familial amyloid polyneuropathy, FAP)等[1]。

载脂蛋白A-II(apoA-II)主要存在于人类、小鼠、大鼠和鱼的血浆中[2-3]。而对于小鼠来说，apoA-II是其血清高密度脂蛋白的第二大组成成分，并通过成核现象(nucleation)和纤维延伸(extension)过程形成淀粉样载脂蛋白A-II(amyloid apoA-II, AApoAII)纤维沉积于各器官中而引起小鼠老化淀粉样变(mouse senile amyloidosis)[4]。研究已知，AApoAII纤维也可以通过粪、乳汁、唾液等途径诱发系统性淀粉样变的发生[5-6]，并且这种老化相关的AApoAII纤维可沉积于脑实质和骨髓以外几乎所有的器官和组织中，如肝脏、脾脏、胃、肠、心脏、肾脏、肺、舌、皮肤和唾液腺等。目前研究发现，朊病毒可通过多种感染途径(如消化道，血液等途径)感染各种组织器官，而朊病毒感染的人、鹿及羊的骨骼肌中均检测出scrapie样异常朊病毒(PrPSc)，并且该类疾病亦可通过骨骼肌进行种属间和/或种属内传播[7-8]。AApoAII淀粉样纤维作为已知的一种淀粉样变前体蛋白，具有与朊病毒相似的传播性及传播途径，但AApoAII淀粉样纤维是否可以通过肌肉进行种内传播未见相关报道。

本实验应用R1.P1-Apoa2c小鼠诱发系统性淀粉样变，并使用Pras’的方法从骨骼肌中提取AApoAII淀粉样纤维，成功地进行了系统性淀粉样变的二次传播实验。本研究首次验证了小鼠老化淀粉样变的骨骼肌传播途径，为淀粉样变疾病的发生机制及防治方法提供了新的有力的理论依据。

1 材料与方法

1.1动物分组 R1.P1-Apoa2c雌性小鼠，60日龄，共计17只，由日本信州大学加龄生物学研究室提供。将实验小鼠进行分组：实验1组6只、实验2组5只、实验3组6只。

1.2模型制备 参照Pras’的方法，从淀粉样变诱导后20个月的R1.P1-Apoa2c小鼠肝脏中提取AApoAII淀粉样纤维种子[9]，并用蒸馏水稀释浓度至1.0 mg/mL。将稀释液用超声打碎后，采用尾静脉注射法进行淀粉样变模型制备，R1.P1-Apoa2c小鼠注射量为100 μg/只。诱导实验进行2个月后，根据Amyloid Index评估心、肝、脾、胃、肠、舌、皮肤各组织淀粉样变沉积程度,分为0～4级：0级，无淀粉样沉积物；1级，约<10%的组织中可见淀粉样沉积物；2级，约10%～30%的组织中可见淀粉样沉积物；3级，30%～50%的组织中可见淀粉样沉积物；4级，>50%的组织中可见淀粉样沉积物。淀粉样变沉积程度为0级以上即为造模成功[5]。

1.3组织标本的取材 待淀粉样变诱导实验进行2个月后即取材。对手术器械、手术操作台及小鼠进行消毒，用乙醚对实验小鼠进行麻醉，将采集的肝脏、心脏、脾脏、皮肤、舌、肠、胃分别置于福尔马林及2.5%的戊二醛中，以便进行淀粉样变程度的判断及部位的判定。

1.4刚果红染色 将福尔马林固定好的组织样品进行刚果红染色，并通过偏光显微镜观察淀粉样沉积程度及位置。

1.5免疫组织化学染色 将福尔马林固定好的组织样品进行免疫组织化学染色，使用鼠apoA-II抗体，稀释浓度为1∶3 000，以特异性判定淀粉样变沉积的程度及部位。

1.6电镜观察 将经2.5%的戊二醛固定好的组织样品用0.1 mol/L磷酸缓冲液漂洗3次，并用1%锇酸固定液固定。经乙醇、丙酮脱水后进行包埋、固化。制备超薄切片，厚度为100 nm，随后用3%醋酸铀-枸橼酸铅双染色，进行电镜观察，以判定淀粉样变沉积部位。

1.7骨骼肌中apoA-II mRNA检测。

1.7.1cDNA合成 使用RNeasy Mini Kit (Qiagen, Germany)从骨骼肌中提取总RNA。利用First strand cDNA Synthesis Kit(Amersham Pharmacia Biotech, USA)合成cDNA, 并通过使用Taq DNA polymerase(Promega, USA)进行PCR扩增。反应产物经3%琼脂糖凝胶(含溴化乙锭)电泳分离，紫外透射仪上观察结果。

1.7.2Real-time PCR 使用SYBR Premix Ex Taq II (Takara, Japan)及7500 Real-Time PCR System进行实时定量PCR。上游引物序列为5′-AAGAGACAGGCGGACGGACA-3′，下游引物序列为5′-GAGGTCTTGGCCTTCTCCAC-3′。

1.8骨骼肌中ApoAI蛋白检测 参照Pras’的方法，从各部骨骼肌中(肱三头肌、股四头肌、胸大肌和背最长肌)提取AApoAII纤维蛋白，采用SDS-PAGE进行电泳分离。转膜后用1∶3 000稀释度的apoA-II抗体检测蛋白表达情况。

1.9二次传播实验 参照Pras’的方法，从骨骼肌中提取AApoAII纤维蛋白，作为“种子”，采用尾静脉注射法进行淀粉样变二次传播实验的诱发，“种子”注射量为100 μg/只。诱导实验进行2个月后，根据上述Amyloid Index方法判断淀粉样沉积情况。同时，将骨骼肌中提取的AApoAII纤维“种子”进行6 mmol/L盐酸胍室温慢速搅拌24 h变性处理，对照实行二次传播实验。R1.P1-Apoa2c雌性小鼠，60日龄，共计12只，将实验小鼠进行分组：阴性对照组3只、诱导实验组3只、盐酸胍变性处理组6只。

1.10统计学分析 使用StatView software package (Abacus Concepts, Berkeley, CA, USA)进行数据分析。所有数据使用Mann Whitney U test进行两组比较。

2 结 果

2.1apoA-II mRNA在肌肉组织中的表达 琼脂糖凝胶电泳图像显示淀粉样变诱导实验进行后，R1.P1-Apoa2c小鼠模型各部分肱三头肌、股四头肌、胸大肌和背最长肌骨骼肌中均有apoA-II mRNA的表达, 但4个部位骨骼肌的mRNA表达程度不尽相同，分别为胸大肌>竖脊肌>肱三头肌>股四头肌，此外，Real-Time PCR结果显示肌肉组织中apoA-II mRNA的表达程度低于肝脏中apoA-II mRNA的表达程度。

图1 apoA-II mRNA 在肌肉组织中的表达

2.2ApoA-II蛋白在肌肉组织中的表达 Western blot结果显示各部分骨骼肌中均有ApoA-II蛋白的表达，且胸大肌中的表达程度最显著。

图2 ApoA-II蛋白在肌肉组织中的表达

2.3形态学观察淀粉样纤维在肌肉组织中沉积部位 刚果红及免疫组化染色结果显示AApoAII淀粉样纤维主要沉积在血管壁(A和C)上及肌纤维之间的间质(B和D)(图3)。(A和B为刚果红染色，C和D为免疫组化染色。放大倍数×400)

2.4电镜观察淀粉样纤维在肌肉组织中沉积情况 电镜结果与免疫组织化学染色和刚果红染色一致(图4),骨骼肌组织中可见直径约为8～10 nm纤维结构(如箭头所示)。

图3 淀粉样纤维在肌肉组织中沉积部位

图4 淀粉样纤维在肌肉组织中沉积情况的电镜观察

2.5二次传播实验结果 通过二次传播实验可见，AApoAII淀粉样纤维沉积的骨骼肌中提取物(图5)可引起系统性淀粉样变; 而提取物进行变性处理后不能诱发二次系统性淀粉样变(图6，表1)。

图5 肌肉组织提取物中淀粉样纤维组分

图6 刚果红染色观察二次传播实验各实验组肝脏组织中淀粉样纤维沉积情况(放大倍数×400)

3 讨 论

根据已有研究证实AApoA-II淀粉样纤维可以引起小鼠系统性淀粉样变，并沉积于小鼠的脑和骨髓以外的全身各器官，如肝脏，脾脏，舌等组织器官,但在骨骼肌组织中是否存在AApoAII纤维，尚未有相关报道。

目前，已有研究显示在患有慢性消耗性疾病的鹿和散发性Creutzfeldt-Jakob病患者的骨骼肌中均有朊病毒蛋白PrPSc的表达[12]。此外，患有AA amyloidosis的牛的骨骼肌中也发现有AA淀粉样纤维的存在[13]。本研究首次发现apoA-II mRNA在小鼠肱三头肌、股四头肌、竖脊肌、胸大肌中均有表达，其表达量低于肝脏中的表达量(图1)，Western blot技术同样检测到4个部位的骨骼肌中存在AApoAII淀粉样纤维，但在4个部位骨骼肌的沉积程度不尽相同，分别为胸大肌>竖脊肌>肱三头肌>股四头肌(图2)，可能与各部位的骨骼肌功能状态和血液供应相关。我们的结果还发现，由前体蛋白apoA-II通过蛋白变构所形成的AApoAII纤维主要沉积于骨骼肌组织的血管壁和肌纤维间质中，而在骨骼肌细胞内和神经纤维中没有发现(图3, 4)。此外，骨骼肌中提取的AApoAII纤维成分，可以诱发淀粉样变二次传播实验(图5,6，表1)。

表1 肌肉组织中提取的淀粉样纤维进行二次传播实验情况

目前研究证实，作为人类食物主要来源的动物肌肉，可以传播传染性海绵状脑病(transmissible spongiform encephalopathy, TSE )[10]；在小鼠、仓鼠和羊的骨骼肌中高表达的朊蛋白(PrPC)可作为朊病毒(PrPSc)复制的底物；大量沉积于鹿的骨骼肌中的朊病毒则可导致慢性消耗性疾病；沉积于人类骨骼肌中的朊病毒PrPSc可以诱发散发性Creutzfeldt-Jacob 病(CJD)。此外，日本的研究人员通过对高龄牛的骨骼肌检测，也发现炎症相关淀粉样蛋白A(AA)同样具有与朊病毒相似的以肌肉为媒介的传播特性[11]。因此，以上研究均支持AApoAII通过骨骼肌进行传播的观点。已有研究发现, AApoAII淀粉样纤维可通过唾液、 乳汁、粪便等媒介进行种间传播，而本实验通过淀粉样变诱导实验首次证实了AApoAII淀粉样纤维可沉积于肌肉组织中，并且可通过肌肉组织进行二次传播。

综上所述，存在于人类、小鼠、大鼠和鱼类血清中的apoA-II，可以诱发小鼠老化淀粉样变，并且以骨骼肌为媒介而传播的可能性是存在的，进一步阐明了淀粉样变疾病的发病机制，并且对此类疾病的治疗和预防方法的研发提供了新的有效的理论实验支持。

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