诺如病毒的研究进展

吴 琼，何玉林

诺如病毒性疾病又被称为冬季呕吐性疾病、胃肠性流感等，是由诺如病毒(Norovirus，NoV)引起的，可感染人和动物引起急性肠胃炎，于1968 年在美国俄亥俄州诺瓦克(Norwalk)镇暴发，1972 年美国学者Kapikian 首先用免疫电镜技术从1968 年暴发的胃肠炎患者样本中检出了病原，定名为诺如病毒[1]。无论在发展中国家还是发达国家，从儿童到成年人都受到诺如病毒的感染，并可造成暴发流行，成为影响人类健康的不可忽视的问题。科学家把每次流行中找到的病毒按照地名依次命名为夏威夷病毒(Hawaii Virus 1977)、蒙哥马利病毒(Montgomery County Virus1977)、马林病毒(Marin County Virus 1981)、雪山病毒(Snow mountain Virus 1988)等，统称为诺如病毒。

诺如病毒归属于嵌杯病毒科(Caliciviridae)诺瓦克样病毒属(Norwalk-like virus)，是一种单链RNA病毒，无囊膜，直径大约27～32 nm。诺如病毒含有40多种不同的病毒株，根据其基因特征，主要分为6个基因型，GI到GⅥ，其中GI、GII和GIV基因型主要感染人类[2-3]，而GIII 和GV 可感染猪、牛和鼠[4]。依据病毒衣壳蛋白(VP1)序列和RNA 依赖的RNA 聚合酶多态性的配对分布，每个基因型可进一步分为不同的基因亚型，GI有8个基因亚型，GII有至少17个，其中基因型GII，亚型4 的诺如病毒(GII.4)，占目前全世界流行的诺如病毒的70%～80%，主要引发人感染病毒性肠胃炎，GII.4可通过定期的点突变或基因重组积累而产生新毒株，表现出基因/抗原的多样化[5]，几乎是每隔两三年便会出现新的变异株，从而引发大的流行[6]。

1 病毒基因组结构与功能

基因组长约为7.5 kb，由3个开放阅读框(openreading frame, ORF)组成(图1-a)，通过生物信息学手段在一些鼠诺如病毒中发现了第4个ORF的存在[7]。病毒的5′共价结合Vpg，据推测，Vpg 的作用是把病毒基因组转运到负链RNA 合成的部位。基因组的3′末端含有polyA 尾。ORF1 为长约5 kb 的非结构蛋白，编码一个约200 kD 的多聚蛋白，被病毒编码的蛋白酶切割后产生6 个小蛋白，从N端到C端依次是：N 末端蛋白、NTPase (核苷磷酸酶)、p22(3A样蛋白)、VPg(与病毒基因组共价结合)、Pro (3C 样蛋白酶)、Pol (RNA 依赖的RNA 聚合酶)[8]。ORF2 和ORF3 编码结构蛋白，ORF2 长约1.8 kb，编码57 kD 的主要结构蛋白VP1；ORF3 长约0.6 kb，编码一个22 kD 的强碱性微小结构蛋白，可能与基因组包装成病毒体有关。

图1 病毒基因组结构和衣壳蛋白结构域[8]

诺如病毒的衣壳蛋白由180 个分子组成，折叠成90 个二聚体，构成了T=3 的二十面体对称结构。衣壳蛋白分为2 个主要的区：外壳区(S区)和突出区(P区)，两者通过灵活的铰链相连。S 区主要涉及到二十面体外壳的形成，形成了一个光滑的病毒基因组外壳，无法与受体结合[9]。P 区从外壳向外形成突起部分，P 区二聚化在衣壳表面上形成拱状突起结构，包含受体结合区域，进一步可分为P1(拱干)和P2(拱顶)，P2是最可变区(图1-b)，包含碳水化合物结合序列和血型组织抗原结合序列[10]。GII.4型病毒的P2结构域包含了高变的抗原表位A-E，与变异株的流行密切相关[11]。这说明此区域含有株特异性决定簇、受体结合位点以及潜在的中和抗体结合位点。

2 细胞培养

鼠诺如病毒能在细胞培养物和小动物中复制，又因为实验室利用小鼠研究的低成本和可操作性，使得小鼠成为研究诺如病毒生物学和致病机理的模式动物[12-13]。鼠诺如病毒可体外感染鼠巨噬细胞系(RAW264.7)、鼠BV-2细胞系和其它的鼠源细胞系，产生典型的CPE[14]。利用基因工程手段，将鼠诺如病毒全长cDNA克隆到牛痘病毒载体MVA-T7(具有T7启动子)中转染BHK-21细胞，可检测到病毒蛋白的表达和RNA的复制[15]。在鸡痘病毒中(FWPV)利用T7RNA聚合酶也能拯救出M诺如病毒[16]。最近研究发现人诺如病毒可在肝癌细胞系(Huh-7)中稳定复制、表达并释放病毒粒子[17]。Timothy M等设计了一个带有旋转管的生物反应器(RWV)，利用胶原包被的多孔微载体珠在三维空间中模拟体内器官和组织的环境，将人诺如病毒接种胚胎肠上皮细胞系(INT-407)，为人和诺如病毒之间相互作用的研究提供平台，使其能更真实的反映体内病毒与宿主的关系[18]。杯状病毒科的水泡状病毒可在细胞培养中很好的生长，并能在亚基因区产生一种独特的衣壳蛋白的前导蛋白(LC)，可见其与水泡病毒在细胞中的复制有关，因此推测LC蛋白可能也与其它杯状病毒在细胞中的有效复制有关，基于这样的假设，Kyeong-Ok Chang等[19]构建了带有绿色荧光标记的全长诺如病毒载体p诺如病毒-GFP，将猫杯状病毒的LC基因区域构建到牛痘病毒MVA-T7，使其表达杯状病毒的LC蛋白，共感染细胞后，可检测到GFP信号细胞量的增加，对照为p诺如病毒-GFP转染细胞，因此推测LC可能是诺如病毒在细胞中复制的增强子。

3 组织嗜性

在利用病毒样颗粒研究的基础上发现，杯状病毒的一个共同特征是可结合到多种形态的糖复合物上(鞘脂糖类，糖蛋白或多聚糖)。许多人类诺如病毒和血型组织抗原HBGAs结合，而鼠诺如病毒可结合到神经节苷脂的唾液酸上。人对诺如病毒的易感性也呈现出多样性，有些人群是诺如病毒的高度易感群，有些人群则可以抵抗病毒的感染，α-岩藻糖基转移酶(FUT2)的表达是决定诺如病毒的易感性所必须的，取决于上皮细胞是否存在海藻糖，FUT2过量表达可增加病毒对细胞的吸附[20-21]，这也许是因为FUT2可在肠上皮细胞催化产生海藻糖。

鼠诺如病毒易感染鼠源巨噬细胞和DC细胞，但不能感染人源或其它动物源的巨噬细胞和DC细胞[13]。对于许多病毒，细胞吞噬和酸性内涵体内的低pH是病毒感染的关键，如在猫嵌杯病毒FCM中研究发现，其可通过网格蛋白途径介导进入哺乳动物细胞的内吞作用[22]。鼠诺如病毒(M诺如病毒)感染巨噬细胞则不需要网格蛋白途径，提高胞内体的pH也不会抑制感染，但其感染可被β-甲基环糊精和肌动蛋白抑制剂(dynasore)抑制，推测M诺如病毒的感染不依赖网格蛋白和pH途径，依赖于肌动蛋白和胆固醇途径[12]。鼠诺如病毒不能与HBGAs结合，巨噬细胞表面表达GD1a, GM1和GA1，利用基因敲除手段发现鼠诺如病毒只可与神经节糖苷(GD1a)结合，不能结合GM1和GA1，这也就表明病毒与GD1a结合的最小的表位应该是唾液酸[23]。在GT1b上存在唾液酸表位，经ELISA验证其能与病毒结合[24]。通常情况下鼠感染诺如病毒都没有临床症状，然而当感染免疫缺陷小鼠(RAG2/STAT1-/-)时，可诱导致死性胃肠炎[25]。Chang等利用反向遗传系统[26]研究发现IFN-α和IFN-γ可在体外抑制诺如病毒的复制和转录，表现出剂量依赖型。在体外和体内，分别观察到了鼠诺如病毒对IFN的敏感性[27]。反向遗传系统可为诺如病毒基因功能及抗病毒研究提供更有力的方法，从基因水平提供了研究病毒与宿主相互作用的方法，这也可为抗病毒药物的研发提供新思路。

4 流行病学

目前报道的诺瓦克样病毒主要来源于海水产品，诺如病毒通常栖息于牡蛎等贝类中，人若生食这些受污染的贝类会被感染。诺如病毒的传染源为感染的患者、隐性感染者及健康携带者。以手-粪-口为主，其次是直接接触传染，或是因前述症状产生的飞沫污染物体表面后间接感染。诺如病毒在半封闭的环境中和人口集中的地区容易暴发，多在寒冷的冬季发病，所以被称为冬季呕吐症。还有一些因素可影响诺如病毒的暴发，比如病毒粒子的高感染性，在环境中的持续存在，感染的患者、隐性感染者的排毒和缺乏持久的免疫力等因素。

人与猩猩是该病毒GI、GII 和GIV 3 个基因型的易感宿主，猪、牛和鼠是GIII 和GV的易感宿主，诺如病毒呈现出广泛的遗传变异性，根据全长衣壳蛋白序列的相似性及进化树分析，每个基因型又可分为不同的基因亚型。其6个基因型之间的病毒衣壳蛋白基因的变异为45%～61%，而人类诺如病毒的变异可达57%。同一基因型内不同病毒株的病毒衣壳蛋白序列具有较高的同源性，为69%～97%，而不同基因型的病毒株只有51%～56%。以GII.4 为例，其6 个不同的亚型的核苷酸变异在2%左右，一般说来，GII.4 的变异大约为10%[28]。这种属内的差异甚至要比其它负链RNA病毒家族属间的差异还要大，这毋庸置疑的成为了限制诺如病毒免疫保护的最重要的原因。大多数的研究都认为同一基因组内的不同基因型具有相似的抗原性，但是最近的研究发现，一些GII.4基因型的进化导致产生配体改变和抗原变异的新毒株[28]。免疫压力以及HBGA- 受体相互作用可能促进衣壳蛋白P2 区末端和暴露的P1 区残基的进化，导致衣壳蛋白结构的变化，并产生新的亚型。重组病毒的快速出现从另一角度表明次要衣壳蛋白VP2和非结构蛋白在病毒进化中也起着非常重要的作用。

诺如病毒不同基因型之间的基因组重组频繁发生[29]，这已成为诺如病毒进化基因多样性的主要策略和动力，也影响其进化分型，混淆分子流行病学研究，并影响疫苗的设计。诺如病毒基因相当大的可变性，对于病毒的生存是十分有利的。还不清楚其基因多态性的快速进化是由于免疫压力，还是由于易于出错的聚合酶及进行重组的能力使得RNA 病毒经历快速的基因漂移。反向遗传系统为诺如病毒的变异和进化研究提供了更有力的方法，在基因水平提供了研究病毒与宿主相互作用的方法。

用人诺如病毒GII.4感染SPF猪和牛，以小鼠感染鼠诺如(M诺如病毒-1)病毒为对照，发现人GII.4可感染SPF猪和牛，可检测到病毒的复制和血清阳性[30]，这说明诺如病毒存在从动物与人之间传播的可能性，诺如病毒的预防和控制必须要考虑到这一点。在小狗和幼狮中发现的GIV型诺如病毒，以及在狗中发现的GVI型诺如病毒均揭示在遗传上相关的病毒可能会在更多的其它物种中发现[31-32]。目前，还没有相关的动物实验来验证诺如病毒是否存在宿主范围扩大的证据，但宠物的感染将对人类的健康造成巨大的威胁。人体内可检测到GIV型诺如病毒的抗体[33]，这也初步证实诺如病毒存在宠物与人之间的传播。病毒从人到动物的传播或是从动物到人的传播所带来的威胁是无法估量的，目前还没有在人类中发现动物的诺如病毒，但是在人体内可检测到动物诺如病毒的抗体，在猪体内也检测到了人诺如病毒的抗体；在双壳贝类中发现了人的诺如病毒，可与动物的诺如病毒同时存在，这都为人们提示诺如病毒在人与动物之间传播的危险性，为预防该病的暴发提出了新的挑战。

5 病毒的感染机制

人感染诺如病毒后，分析肠近端活组织切片发现完整的肠粘膜有特异性的组织变化，包括绒毛的扩大和钝化，微绒毛缩短，线粒体变大，胞浆空泡化，细胞间水肿。电镜分析，这些细胞形态仍然是完整的。除了肠的变化，诺如病毒感染人类后还会在粘膜固有层产生微弱的炎症反应，十二指肠的上皮细胞毒性T细胞有所增加[34]。诺如病毒可引起的人类、猪、和鼠肠细胞的凋亡，体外表达ORF1的多聚蛋白便可足以诱导健康细胞的凋亡[35]，主要是通过下调表达生存蛋白(survivin)，激活caspase-9诱导细胞凋亡。小鼠杯状病毒和猫杯状病毒已被证明在体外通过线粒体途径导致受感染的巨噬细胞和上皮细胞凋亡，而体内细胞凋亡可能是由于受感染的直接影响[36]。Troeger等推测，诺如病毒感染时上皮细胞内CD8+T淋巴细胞的涌入可能会导致在释放穿孔蛋白后肠囊肿细胞的凋亡[34]。因此，诺如病毒引起的肠上皮细胞凋亡存在直接和间接的机制。

以往认为诺如病毒的感染都被局限在肠部位，但最近的几项研究表明，情况并非如此。在感染的个体15%可在血清中检测到诺如病毒RNA[37]。在动物模型中研究发现，病毒的传播可穿过肠部位。SPF牛感染诺如病毒后有50%的可出现短暂的病毒血症，20%可在血清中检测到诺如病毒RNA[37]。鼠诺如病毒可通过感染DC细胞，传播至引流淋巴结，感染肠系膜淋巴结和周边组织，并可在脾脏有效地复制，导致脾脏病变。目前对诺如病毒的感染、致病机制，物种与组织嗜性，病毒与宿主相互作用，靶细胞受体，在细胞内的复制过程等基础研究相对较少，这也严重阻碍了人们对该病毒的认识，未来的研究期望能在致病机理上有较大突破。

6 检测技术

目前实验室诺如病毒检测有3种方法: 电镜法； 免疫学方法； 分子生物学方法。

6.1电镜法 取发病后24～48 h 大便作免疫电镜检查，可见病毒颗粒，但因为诺如病毒缺乏典型的杯状病毒特征，而且常因病毒量少而难以发现。

6.2免疫学方法 免疫学方法包括放射免疫法(RIA)、生物素- 亲和素免疫法(Biotin- Avidin Imunoassy)和酶联免疫法(ELISA)。RIA 灵敏度比IEM法可提高10～100 倍，可检测出抗体消长的水平。不足之处在于耗时长，且需要放射性同位素标记。为了简化方法，美国疾病预防控制中心建立了生物素—亲和素免疫法，其灵敏度与RIA法相当。以抗重组衣壳超免抗血清为基础的捕获ELISA 技术已经问世多年，现在已经应用于商业。李潇[38]等以E.coli表达的GII组广州株NV全长衣壳蛋白作为免疫原，免疫BALB /c小鼠并制备mAb，E.coli表达系统操作简便，重组蛋白产量高，并且可以使用配套纯化方法对重组蛋白进行高度纯化为研制诺如病毒检测试剂盒奠定基础。使用单克隆抗体(mAb)捕获患者粪便标本中的病毒抗原来进行检测的方法(夹心ELISA)由于交叉反应性小，特异性较强且敏感度较高，成为目前研制诺如病毒检测试剂所主要采用的方法。

6.3分子生物学检测技术 RT-PCR已广泛应用于诺如病毒的检测, 成为诺如病毒诊断的金标准，敏感性及特异性均较好。多重RT-PCR 能同时诊断诺如病毒, 星状病毒和轮状病毒。尤其对于低浓度的诺如病毒感染，其最大的优点在于可以进一步对病毒进行基因型的研究，不会受到获得分型单克隆抗体的限制，对流行病学研究具有重要意义。陈宗峰[15]等建立了逆转录环介导等温扩增技术(RT-LAMP)，它能够识别靶DNA 上6 个特定区域的4 条引物和一种具有链置换活性的DNA 聚合酶，在恒温条件下高效扩增核酸，具有高特异性、快速灵敏、高效、操作简便等特点，与RT-PCR技术相比，RT-LAMP法更加简便快速，能够在等温条件下进行，特异性好,具有更高的灵敏性。但诺如病毒相当高的变异性使得开发针对所有变异株的检测方法很困难。

诺如病毒基因型复杂，不同型别的序列变化大，大多数检测方法只能针对一种或几种型别进行检测，这在实际应用中会导致假阴性的发生。因此，研究出能够灵敏、特异地检测所有型别诺如病毒的方法具有较大意义。Thongprachum等最近研究出了免疫层析试剂盒(IC-kit)可用于从患者粪便样品中快速检测诺如病毒，其与RT-PCR相比灵敏度为74.2%、特异性99.5%和结果的一致性96.1%。基于NoV的系统进化分析，其能检测出NoV GII/3， GII/4，GII/6，GII/13， GII/15，和GII/16 基因型，因为其使用的是多克隆抗体，因此可同时用于检测更宽范围的型别[39]。检测技术的发展，尤其是PCR技术的应用，对NoV传播特点、分布规律与分子进化机制的研究具有重要意义。同时，PCR技术还促进了NoV序列的积累，这不但有助于了解病毒基因组特征，而且还加深了对其进化机制的认识。

7 疫苗研究进展

目前认为诺如病毒抗体没有明显的保护作用，尤其是长期免疫作用。研究表明，GI型病毒之间存在广泛的抗体交叉反应，而遗传学上相似的GII型病毒由于其抗原的高度变异而表现出较低的交叉保护[40]，这也严重抑制了诺如病毒疫苗的研制，尤其是对于人群中暴发流行的GII.4型毒株。同时，人类诺如病毒短期免疫的表现也是复杂的，即使在儿童时期感染过诺如病毒，有些健康的成人中诺如病毒的发病率和感染率仍然较高。很显然，诺如病毒感染后仅产生有限的短期免疫力，但对于人类诺如病毒感染和发病后的免疫力的研究仍然很有限。虽然人和鼠诺如病毒的细胞培养已取得了一定的进展，但迄今尚无病毒疫苗问世，阻碍诺如病毒疫苗发展的一个重要原因是病毒的高度异质性。

目前，诺如病毒疫苗的研究主要集中于在各种系统中表达衣壳蛋白，因为衣壳蛋白可自组装为病毒样颗粒(VLP)，能模拟真实病毒粒子的抗原结构，耐酸，耐热，具有抗原性和免疫原性，可刺激机体产生免疫反应，主要为血清IgG 和 粘膜IgA反应。在各种系统中包括昆虫，动物和植物系统表达病毒VP1产生的病毒样颗粒(VLPs)的抗原性和形态特征等天然病毒粒子相似。用从昆虫和植物体系中产生的诺如病毒-VLPs经口服方式免疫小鼠，可刺激产生系统性和粘膜的诺如病毒抗体，诺如病毒-VLPs鼻内注射也具有高免疫原性，能以较低的剂量刺激产生系统性和粘膜的诺如病毒抗体，口服和鼻内注射都可在远端粘膜部位产生抗体[41]。这表明诺如病毒-VLPs可递呈通过基因融合手段产生的异源多肽抗原。Guo 等[42]利用重组腺病毒系统表达诺如病毒衣壳蛋白经鼻免疫小鼠，也获得了较好的体液免疫、黏膜免疫和细胞免疫反应，这为诺如病毒疫苗的研究提供了新的思路。戊型肝炎病毒(HEV)疫苗的问世也为诺如病毒疫苗的研制提供了良好的平台，它们都属于肠溶性传播的病毒，并且都具有相似的由表面衣壳蛋白P结构域二聚体的突出结构，以此设计出的嵌合双价疫苗，将诺如病毒的P端融合到HEV的P端，原核表达NoV P--HEV P融合蛋白，免疫小鼠后可产生高滴度的中和抗体[43]。近年来，随着生物信息学的飞速发展，科学家们可通过计算机模拟来预测GII.4的分子进化规律，并以此为背景，将不同毒株GII.4的抗原决定簇嵌合表达出VLP[44]，显示出对不同毒株GII.4广泛的保护效果，其效果比多价GII.4混合疫苗更显著，有望用于人群中诺如病毒的暴发和控制。

8 小 结

最新的研究发现，诺如病毒作为食源性的胃肠道病原体，正在取代主要引发儿童胃肠道疾病的轮状病毒而成为最主要的人类胃肠道疾病的病原体[45]，其在世界范围内的流行和暴发是与诺如病毒的持续存在及其不断变异和进化密切相关的。GII.4仍然是全球的优势基因型，并在2012年出现了新的变种，称为Sydney 2012。重组DNA技术的出现以及在生物技术产业中的应用也为动物传染病的诊断提供了新的方法，因为重组的抗原缺乏宿主的胞内蛋白，可以大大降低假阳性反应发生率，提高了快速性，特异性和各种诊断检测的灵敏度。作为一种新的诊断方法，以期能够用于诺如病毒的检测。

由于诺如病毒基因组内和基因型之间的高度变异，使得疫苗无法交叉保护，VLP 可以作为非复制型颗粒黏膜免疫的良好模型，利用基因重组的手段嵌合表达不同毒株的抗原决定簇制备的嵌合VLP疫苗以期在疾病暴发时能表现出强大的力量。研究VLP 的表面结构和受体结合域，有助于鉴定外源蛋白潜在的插入位点，将有助于提高VLP 组装和结合受体的有效性。基于人和鼠诺如病毒的细胞培养研究，渴望在不久的将来能有商品化的疫苗投入使用。然而，诺如病毒的快速进化也为流行病学的研究和疫苗的研制提出了挑战，未来对诺如病毒疫苗的研究还需不断努力。除了流行病学特性，对我国诺如病毒的分子生物学特征，例如病毒的全基因结构、致病机制、病毒重组和进化等方面的了解不多，因此，对以上各方面均有必要进行深入研究。

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