新疆北疆地区猪Torque teno病毒的PCR检测和序列分析

施研进，王礼伟，屈勇刚，石家成，杨 媛

Torque teno virus(TTV)是一种单股环状DNA 病毒, 属圆环病毒科指环病毒属[1]。1997年，由日本学者Nishizawa等[2]首次发现于输血后表现肝炎的患者血清，故又被称为输血传播病毒。TTV在不同的人群中感染率较高，DNA 阳性率一般在10%以上，高的可达80%左右[3-4]。已经证实，除人类外，猪、牛、羊、猫、狗、家禽等多种动物可以感染TTV[5]。目前认为，猪源TTV有TTV1和TTV2两种基因型[6]。研究发现，不同国家、不同地区的猪群中均存在TTV感染[5-7]。Segales等对1985-2005年间99个西班牙农场中162份猪血清进行TTV检测，研究发现母猪和商品猪的TTV1感染率分别为34.2 %和30.9%；TTV2的感染率分别为46.6%和62.8%，混合感染率分别为19.8%和24.5%[8]。Martinez 等[7]采测了欧洲178头野猪样本，检测发现 TTV1阳性率为58%，TTV2 阳性率为66%。我国猪TTV研究起步较晚，2009年，王礞礞等[6]首次证实我国猪群存在TTV感染，并获得了TTV1和TTV2全长基因序列。随后，大量研究表明我国猪群普遍存在TTV感染[4,6,9-11]。为了了解有关新疆北疆地区猪TTV感染的流行病学，本研究分别以TTV1和TTV2基因组保守序列设计引物，应用PCR检测技术对该地区猪群中TTV感染状况进行调查。

1 材料与方法

1.1血液样品 109份抗凝血液采自新疆北疆地区某生猪屠宰厂。

1.2主要试剂 血液基因组小量提取试剂盒、PCR扩增试剂2×EsTaq Master Mix、DNA Marker DM2000、DNA琼脂糖凝胶回收试剂盒均为北京康为世纪生物有限公司产品；pMD18-T载体由TAKARA公司生产；感受态大肠杆菌E.coliDH5α由本实验室制备。

1.3PCR检测引物设计 根据参考文献[11]设计合成了如下两对引物，分别用于扩增 TTV1 和TTV2 的非编码区序列，其序列见表1。

表1 TTV PCR检测用引物序列

1.4总DNA的提取 根据北京康为世纪生物有限公司血液基因组提取试剂盒说明书操作。其中提取DNA时，每个血液样品加入量为300 μL，加入3倍体积的Buffer GR，其余步骤与操作说明相同。

1.5PCR扩增 扩增猪TTV1时，引物选用TTV1F和TTV1R；扩增猪TTV2时，引物选用TTV2F和TTV2R(如表1)。PCR反应体系为：2×EsTaq Master Mix10 μL、上游引物0.2 μL、下游引物0.2 μL、Rnase-free water 7.6μL、DNA模板2 μL，总反应体系为20 μL。TTV1的反应条件为：94 ℃预变性4 min，94 ℃变性30 s，58 ℃退火40 s，72 ℃延伸30 s，共35个循环，最后72 ℃延伸10 min；TTV2的反应条件为：94 ℃预变性4 min，94 ℃变性30 s，60 ℃退火40 s，72 ℃延伸30 s，共35个循环，最后72 ℃延伸10 min。

1.6PCR产物的鉴定 取 PCR 产物10 μL，用1.5%的琼脂糖凝胶进行电泳，通过凝胶成像仪进行观察。

1.7PCR产物的序列测定 PCR产物经过电泳、切胶后，通过DNA琼脂糖凝胶回收试剂盒进行纯化，连接至pMD18-T 载体上，转入感受态细菌DH5α，通过氨苄抗性进行筛选。阳性克隆经菌落PCR进一步鉴定后，保存于50%的灭菌甘油中，送北京华大基因生物技术公司测序。

1.8基因序列的同源性分析 所获基因序列排序与比较使用Clustal X(verion1.8)、DNAStar，系统进化分析使用Phylip软件包，系统发生树的构建使用邻位相连法(Neighbor-Joining，NJ)。分析使用1 000次replicate。其中所用的参照序列见表2。

表2 分析中所用的参照序列

2 结 果

2.1PCR检测结果 正式试验以前，先选取少量样品进行PCR检测，对PCR检测阳性者进行核酸序列测定和比对分析，确定为TTV核酸序列后作为正式试验的阳性对照。本次试验共检测了109份猪血样，其中TTV1检测出与阳性样品吻合的样品有62份，TTV1的感染率为56.88%(62/109)；TTV2检测出与阳性样品吻合的样品有24份，TTV2的感染率为22.01%(24/109)；TTV1和TTV2混合感染率为18.34%(20/109)。部分样品的电泳结果见图1、图2。

图1TTV1检测结果

Fig.1ResultsoftheporcineTTV1PCRdetectioninthenorthernregionofXinjiang

1: Positive control; 2-6: Samples; 7: Negative control; M: marker.

图2TTV2检测结果

Fig.2ResultsoftheporcineTTV2PCRdetectioninthenorthernregionofXinjiang

1, 2, 5, 6, 7: Samples; 4: Positive control;

3: Negative control; M: Marker.

2.2阳性克隆PCR检测结果选取TTV1和TTV2的阳性样品，再次进行PCR扩增，纯化后进行基因克隆，结果克隆得到TTV1基因片段3个，命名为TTV1S、TTV1A1、TTV1A2；克隆得到TTV2基因片段4个，分别命名为TTV2S1、TTV2S2、TTV2A1、TTV2A2，PCR验证正确，并全部正确测序，见表3。

表3用于序列分析的样品及来源

Tab.3Samplesandtheirsourcesusedfornucleotidesequenceanalysisinthisstudy

StrainGenotypeSourceCountyTTV1S1swineShiheziTTV1A11swineAletaiTTV1A21swineAletaiTTV2S12swineShiheziTTV2S22swineShiheziTTV2A12swineAletaiTTV2A22swineAletai

2.3序列分析结果 通过Clustal X排序后，进行比对分析，所获TTV1和TTV2序列与参照序列的同源性分别为89.4%～95.2%、81.1%～99.2%；所获TTV1序列之间的同源性为94.2%～100.0%，所获TTV2序列之间的同源性为85.5%～99.1%，分别见图3、图4。所构建的系统发生树见图5、图6。

图3新疆北疆地区猪TTV1与参照序列的同源性比较

Fig.3NucleotidesequencehomologycomparisonoftheporcineTTV1inthenorthregionofXinjiangandthereferenceTTV1strains

图4新疆北疆地区猪TTV2与参照序列的同源性比较

Fig.4NucleotidesequencehomologycomparisonoftheporcineTTV2inthenorthernregionofXinjiangandthereferenceTTV2strains

3 讨 论

王礞礞等[6]对2008-2009年采集自国内7个省份的258份组织样品进行了TTV 感染情况的调查，结果证实在我国的猪群中存在TTV的感染，其中TTV1 感染率为37.6%，TTV2感染率为82.6%，TTV1和TTV2的共感染率为38.4%。随后，訾占超等[11]通过双重PCR 检测发现，我国猪群TTV的总体感染率为63.37% (1 261/1 990)，其中TTV1感染率为55.88 %(1 112/1 990)，TTV2为32.91%(655/1 990)，TTV1和TTV2 双重感染率为25.43 %。大量研究证实，我国猪群普遍存在TTV感染，感染情况比较严重。

图5新疆北疆地区TTV1部分核苷酸序列构建的系统发生树

Fig.5PhylogenetictreeofpartialnucleotidesequenceofTTV1strainsisolatedfromthenorthernregionofXinjiang

图6新疆北疆地区TTV2部分核苷酸序列构建的系统发生树

Fig.6PhylogenetictreeofpartialnucleotidesequenceofTTV2strainsisolatedfromthenorthernregionofXinjiang

通过本研究发现，在新疆北疆地区，猪TTV1的感染率为56.88%(62/109)；TTV2的感染率为22.01%(24/109)；TTV1和TTV2混合感染率为18.34%(20/109)；所获TTV1和TTV2序列与参照序列的同源性分别为89.4%～95.2%、81.1%～99.2%，所获TTV1序列之间的同源性为94.2%～100.0%，所获TTV2序列之间的同源性为85.5%～99.1%。证实新疆北疆地区猪群存在TTV感染。与国内其他研究结果相比较，发现新疆北疆地区猪TTV1的感染率均高于王礞礞、訾占超等的检测结果，说明新疆北疆地区TTV1感染率处于一个较高水平；然而，本研究中的TTV2的感染率和共感染率均低于其他地区，表明本地区TTV2的感染率相对较低。对出现这一现象的原因有待进一步深入研究。

至今尚不明确猪TTV感染会引起何种疾病。虽然，Kekarainen等[12]在研究猪血清中的TTV 病毒时，发现其流行与猪圆环病毒 2型(PCV2)的流行具有一定的关联性，在患有断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)的猪群中，TTV的感染率为97%，在没有被PMWS感染的猪群中TTV的感染率为78%。在流行病学角度提示了猪TTV和PMWS之间存在一定联系。而TTV感染与PMWS的关系，或其致病机理有待进一步研究。

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