中国汉族人群不明原因猝死与NOS1AP基因多态性的相关性

黄京璐，郝博，王小广，刘宏，李明，权力，盛立会，刘超，罗斌，3

（1.中山大学中山医学院法医学系，广东广州510080；2.广州市公安局刑事科学技术研究所，广东广州510030；3.司法部司法鉴定科学技术研究所上海市法医学重点实验室，上海200063；4.深圳市公安局刑事科学技术研究所，广东深圳518000）

不明原因猝死（sudden unexpected death，SUD），是指貌似健康而无明显症状的人，由于机体潜在的疾病或重要器官（心、脑、肺）急性功能障碍导致的突然（多在1h内）、意外的非暴力性死亡[1]。近年来报道运动中猝死的案例越来越多[2]，但由于尸检中无特异性病变，发病原因至今仍未能确定，常易引发纠纷。目前普遍认为不明原因猝死者生前发生潜在的致死性心律失常（原发性电生理异常），如长QT综合征、Brugada综合征和预激综合征（pre-excitation syndrome），多由心脏钾、钠离子通道基因突变介导[3-5]。有研究[6]表明，运动中猝死与长QT综合征、肥厚性心肌病、马凡氏综合征（Marfan syndrome）等多种遗传性心脏疾病有关。NOS1AP基因编码心脏一氧化氮合酶受体蛋白，该蛋白通过调节钾离子通道、钠离子通道、钙离子通道参与心肌复极化过程[7]。部分学者[8-11]发现NOS1AP基因的SNP位点与心源性疾病（如致死性心律失常、冠心病等）和2型糖尿病具有相关性，并多见于白种人群（高加索人种群）。本研究以一般日常活动中SUD为研究对象，通过基因测序分析NOS1AP基因SNP（rs10494366、rs10918859、rs12143842、s12742393、rs3751284、rs348624），旨在探讨NOS1AP基因SNP多态性表达与一般日常活动猝死的相关度，寻求该类猝死案的分子学死亡机制和新的诊断指标。

1 材料与方法

1.1 研究对象

中山大学法医学系病理教研室2011—2013年检案中筛选出60例SUD者的心血样本作为SUD组，其中男性48例，女性12例，平均年龄为（37.3±12.4）岁。入选标准[12]：死者均处于一般日常活动状态（如体力劳动、体育运动、情绪激动、静息工作等），生前无重大疾病史，死后经系统法医解剖及病理学诊断后排除暴力、中毒、重大疾病等原因致死，死亡迅速（大多数在1h内），组织病理学观察未见各器官存在致死性病变。

中山大学法医鉴定中心物证教研室提供的2011—2013年随机抽取的无关个体外周血样本（亲子鉴定的正常人群）80例作为对照组，其中男性63例，女性17例，平均年龄在（31.9±10.3）岁。

1.2 DNA提取、产物PCR扩增与测序

取100 μL全血置于1.5 mL微量离心管，加入500 μL灭菌双蒸水，混匀静置10 min，以离心半径10cm，10000r/min，离心10min，弃上清液。在沉淀物中加入200μL 5%Chelex-100（100~200目），56℃孵育2h，100℃水浴10min，高速旋涡振荡10s，以离心半径10cm，10000r/min，离心4min，取上清液作PCR扩增。

用Primer 5软件进行设计引物（表1），由上海美吉生物医药科技有限公司合成引物。PCR反应体积为25 μL，含GoTaq®Green Master Mix（2×Green GoTaq®Reaction Buffer，400 μmol/L dATP，400 μmol/L dGTP，400 μmol/L dCTP，400 μmol/L dTTP，3 mmol/L MgCl2，美国Promega公司）12.5 μL，10 μmol/L上下游引物（上海美吉生物医药科技有限公司）各1μL，DNA溶液3μL，最后加入不含核酸酶的水至25μL。扩增程序：95℃2min；95℃30s，58℃40s，72℃50s，35个循环；72℃10min。PCR产物纯化和测序由上海美吉生物医药科技有限公司完成。最后用BioEdit 7.0.9.0软件（美国Borland公司）进行比对分析。

表1 NOS1AP基因SNP相应引物及产物

1.3 测序数据分析

依据测序结果判读各样本在上述6个SNP位点的基因型，计算并比较各SNP位点在SUD组和对照组的等位基因频率和基因型频率，并进行Hardy-Weinberg平衡检验。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 日常活动状态下SUD人群一般情况

60例一般日常活动中猝死者中，15例死前被目击从事体力劳动，5例死于打篮球及跑步等体育运动，8例死前曾与他人争吵，3例死前有饮酒行为，3例死于步行中，3例死前正接受静脉输液治疗而被怀疑药物过敏性休克，2例弯腰拾物后突然倒地，2例术后突然猝死，2例死前曾服用药物而被怀疑药物中毒，2例起床时突然倒地，2例死前正在网吧上网，1例在看电视时猝死。其中3例接受静脉输液治疗及2例服用药物死亡的死者均通过药物化验、IgE检测及组织病理学检测排除中毒或过敏性休克死亡的可能，2例术后猝死者也经系统解剖检验排除手术致死的可能。此外12例死者因随访资料不齐全难以分类，但案情显示死前无明显诱因出现头晕、头痛、口吐白沫、身体抽搐、胸痛、神志不清、昏迷等症状，送医院抢救无效死亡，均处于一般日常生活非睡眠静息状态。

2.2 NOS1AP基因SNP位点在两组人群中的等位基因频率和基因型频率

所检测的6个SNP位点在SUD组和对照组人群的基因型分布均处于Hardy-Weinberg平衡状态，P＞0.05。NOS1AP基因SNP（rs10494366、rs10918859、rs12143842、rs12742393、rs3751284、rs348624）的等位基因频率和基因型频率在两组人群的多态性分布详见表2。本实验检测的rs10494366、rs12143842、rs12742393、rs348624基因频率与美国国家生物技术信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）的dbSNP数据库比对后数值较为相近；rs10918859位点的最小等位基因频率（minor allele frequency，MAF）值（A等位基因）在SUD组为0.450，在对照组为0.375，在SNP数据库为0.210 3，存在差异；rs3751284位点的MAF值（C等位基因）在SUD组为0.325，在对照组为0.475，T等位基因（同义突变）是优势等位基因，而SNP数据库MAF值（T等位基因）为0.4224，C等位基因为0.5776，C等位基因是优势等位基因，两者有较大差异。

表2 NOS1AP基因SNP在SUD组和对照组人群中的基因型频率和基因频率

2.3 NOS1AP基因SNP位点与SUD人群的关联分析

rs3751284位点的等位基因频率和基因型频率在两组人群中的分布差异均有统计学意义（P＜0.05）。

3 讨论

3.1 NOS1AP基因与心肌复极化

NOS1AP基因位于第1号染色体，有10个外显子，编码一氧化氮合成酶受体蛋白，具有调节神经元一氧化氮合成酶活性和通过神经元三元复合体一氧化氮合成酶促进Dexras1激活的作用[13]。NOS1AP基因包含可以与心肌和神经元的几种离子通道相结合的PDZ区域，对正常人的QT间期时间起决定性作用，提示NOS1AP是影响心脏电生理的重要基因，通过介导离子通道的突变基因（KCNQ1、HERG、KCNE1、KCNE2等）而影响心肌细胞对自律性改变的敏感性，导致心动过缓、心室复极延迟或致死性心律失常[7]。神经元NOS1AP基因敲除小鼠心肌收缩力发生了改变，表明NOS1AP基因编码的蛋白在心脏复极化过程中发挥重要作用，而携带原发性长QT引发的突变或携带NOS1AP基因两种突变的任何一种，都将增加心脏骤停或猝死的可能性[14]。已发现在白种人中NOS1AP基因的SNP与心源性猝死存在关联[11，15]。

3.2 NOS1AP基因rs3751284位点与活动中SUD

本实验通过群体关联分析后证明，rs3751284位点的等位基因频率和基因型频率分布在SUD组与对照组中差异有统计学意义，提示其与SUD可能存在关联。rs3751284位点位于NOS1AP基因的第六外显子，C等位基因突变为T等位基因后，其编码的丝氨酸未发生改变，属于同义突变（synonymous mutations），也称沉默突变（silent mutation）。一直以来基因突变改变了氨基酸序列被认为是影响蛋白质的功能发挥，而替换的核苷酸无氨基酸变化被认为是无害的、中性的，不影响蛋白质的功能。然而越来越多的研究[16-18]表明，同义突变可能影响转录后加工、切接信号顺序、启动子区重要碱基及翻译过程，最终可能影响基因的表达。同时在蛋白质的翻译过程中，需要tRNA携带氨基酸残基结合到核糖体上，这个时候由于存在同义突变，尽管最后合成的蛋白质一样，但合成过程中使用的tRNA量不一样，如果同义突变后对应的某种tRNA在胞内较少，则影响蛋白质的合成效率，也会影响该基因的表达。

rs3751284位点在SUD组与对照组两组人群中的分布差异有统计学意义，提示rs3751284位点可能是SUD的易感基因位点，携带rs3751284位点T等位基因（同义突变）的人群相对于C等位基因的人群可能更容易引起猝死，这对猝死研究有参考价值。SUD的死亡机制仍未清楚，由此推测其不是由单一SNP突变造成，可能多个SNP位点均有突变或存在其他易感基因位点，部分日常活动可能是猝死的诱因之一。本实验后期将进一步开展对NOS1AP基因的全部外显子、内含子、两侧拼接部位的测序研究。

本实验还通过对SUD组与对照组两组人群rs10494366位点的相关性分析后发现差异没有统计学意义。Koskela等[19]通过对1963例芬兰志愿者进行运动测试，其中女性志愿者经过体育运动后，携带不同NOS1AP rs10494366基因型（TT、TG、GG）的志愿者的T波改变差异有统计学意义，T波改变直接影响QT间期而导致心肌复极化的改变，可反映体育运动有一定的诱导作用。

3.3 NOS1AP基因与冠心病猝死

心源性猝死指由于各种心脏原因所致的突然死亡。可发生于原来有或无心脏病的患者中，常无任何危及生命的前期表现，突然意识丧失，在急性症状出现后1 h内死亡，属非外伤性自然死亡，特征为出乎意料的迅速死亡，包括冠状动脉疾病、心肌病、心律失常等。现有文献[8，20]报道中国汉族男性人群及白种人群NOS1AP rs10918859多态性与冠心病相关；本实验rs10918859位点的多态性表达在SUD组与对照组两组人群中差异无统计学意义，与文献报道不一致，间接说明SUD致死机制可能与冠心病猝死不同。

现有文献[21-22]报道rs3751284位点的多态性表达与精神分裂的发生相关，NOS1AP通过调节NMDA受体参与神经元谷氨酸神经传递过程，该神经传递异常将导致精神分裂的发生。本实验结果显示，rs3751284位点的MAF值（C等位基因）在SUD组为0.325，在对照组为0.475，T等位基因是优势等位基因；而dbSNP数据库报道为MAF值（T等位基因）为0.422 4，C等位基因为0.577 6，C等位基因是优势等位基因，两者有较大差异，考虑可能中国汉族人与高加索白人有种族差异性。文献报道中国人群猝死发生率高[23-24]，而欧美国家报道婴幼儿猝死发生例数较多[25-26]。本实验显示中国人群rs3751284 T等位基因（同义突变）较高加索人种频率高，其MAF值能否间接反映种族差异及与猝死关联度有待进一步验证；当然也不排除扩大样本量后该差异消失的可能。

本实验通过对活动中SUD人群NOS1AP基因SNP进行研究，发现中国人群rs3751284位点的基因频率和基因型频率在SUD组和正常人群组的分布差异有统计学意义，其多态性可能与部分活动中SUD密切相关。

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