斑点叉尾鮰（Ictalurus punctatus）LEAP2成熟肽在大肠杆菌中的融合表达

高北 陶妍

（上海海洋大学食品学院，上海 201306）

斑点叉尾鮰（Ictalurus punctatus）LEAP2成熟肽在大肠杆菌中的融合表达

高北 陶妍

（上海海洋大学食品学院，上海 201306）

以斑点叉尾鮰（Ictalurus punctatus）肝脏为基因克隆的材料，通过RT-PCR对编码LEAP2成熟肽区域41个氨基酸的cDNA片段（mLEAP2）进行克隆。根据斑点叉尾鮰与其他鱼类、哺乳动物及两栖动物等其他物种LEAP2成熟肽区域氨基酸序列的比对结果，发现存在14个保守的氨基酸残基，其中4个高度保守的半胱氨酸残基位于成熟肽的羧基端区域，在空间上可形成两对二硫键，推测与LEAP2的抗菌活性有关。进一步构建重组表达质粒pET32a-mLEAP2，使mLEAP2基因与携带有6 × His-tag标签和肠激酶识别位点的硫氧还蛋白trxA基因融合，转化至大肠杆菌BL21（DE3）后，在25℃下，经0.7 mmol/L IPTG诱导培养16 h后，成功表达了trxA-mLEAP2融合蛋白。Tricine-SDS-PAGE显示，细胞经超声破碎后，上清和沉淀中均含融合蛋白，采用固化金属离子亲和层析（IMAC）对其进行纯化，得到了纯化的融合蛋白。

斑点叉尾鮰 LEAP2成熟肽 RT-PCR 融合表达

抗菌肽是一类内源性的具有强抗菌作用的阳离子短肽，其分子量一般为1.5-10 kD，是生物先天免疫功能的重要组成成分［1］，因其具有天然、无毒的优势，有望作为绿色饲料添加剂部分替代抗生素。此外，抗菌肽又被称为“第二防御体系”，对一般抗生素不能起效的许多真菌、原虫、有包膜的病毒乃至癌细胞等有抑制作用［2］。从人血液超滤产物中得到含有4对和2对二硫键的肝脏表达的抗菌肽，分别被称为肝脏表达的抗菌肽-1（Hepcidin，LEAP1）和抗菌肽-2（LEAP2）。关于LEAP1的研究已较为深入，而关于LEAP2的研究报道则相对较少。鱼类中的LEAP2基因首次发现于虹鳟鱼［3］（Oncorhynchus mykiss）体内。近几年以来，其他一些鱼类的LEAP2基因被相继克隆，如斑点叉尾鮰（Ictalurus punctatus）［4，5］、牙鲆（Paralichthys olivaceus）［6］、大黄鱼（Larimichthys crocea）［7］、 草 鱼（Ctenopharyngodon idella）［8］等。斑点叉尾鮰LEAP2基因含有3个外显子和2个内含子，该基因编码的多肽由94个氨基酸残基组成，自氨基端起Pro-28与Ser-29之间可产生一个酶切位点，将28个氨基酸残基的信号肽与66个氨基酸残基组成的LEAP2原前体肽分开；原前体肽由前体肽区域和成熟肽区域组成，经加工后释放出具生物活性的含41个氨基酸残基的成熟肽［4，5］，两对二硫键就位于该成熟肽区域内。传统的制备抗菌肽的方法主要是从生物的组织器官中提取，但该法存在许多问题，如提取量低、杂质种类复杂、易失活等，严重制约了抗菌肽的开发和应用，而化学合成法成本很高。因此，通过基因工程技术制备抗菌肽无疑是一条良好的途径。张虹等［4］通过RTPCR对包括信号肽在内的LEAP2 全长cDNA进行了克隆并实现在E.coliBL21（DE3）中的原核表达。本研究以斑点叉尾鮰肝脏为材料，通过RT-PCR对编码LEAP2成熟肽区域的cDNA进行克隆，并构建重组融合表达载体对其进行原核表达，为进一步研究LEAP2的抗菌活性奠定了重要基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和质粒 用于模板的斑点叉尾鮰肝脏cDNA为本实验室保存。用于质粒复制和cDNA克隆的大肠杆菌菌株DH5α和用于目的蛋白表达的大肠杆菌BL21（DE3）购自北京天根生物科技公司；克隆质粒pSURE-T购自北京艾得莱生物科技公司；表达质粒pET-32a（+）购自美国Novagen公司。

1.1.2 主要试剂及设备 RNA提取试剂Trizol购自美国Invitrogen公司；Ex Taq DNA 聚合酶、T4 DNA连接酶、EcoR I和Hind III购自TaKaRa公司；质粒提取试剂盒、DNA回收试剂盒、DNA 分子量marker和蛋白质分子量marker购自北京天根生物科技公司；IPTG购自上海生物工程有限公司；LB营养肉汤及其他化学试剂购自国药集团化学试剂有限公司，为国产分析纯；引物合成及测序由上海生物工程有限公司完成；蛋白纯化仪Profinia及其固化金属离子亲和层析柱（IMAC）和脱盐柱购自美国Bio-Rad公司。

1.2 方法

1.2.1 LEAP2成熟肽基因的cDNA克隆 以前期研究中通过逆转录得到的斑点叉尾鮰肝脏cDNA为模板［4］，参考LEAP2全长cDNA序列（GenBank ID：NM_001200205）设计含有EcoR I酶切位点的正向引物MLF（5'-CGGAATTCATGACACCCCTTTGGAGAATC-3'）和含有Hind Ⅲ酶切位点的反向引物MLR（5'-CCCAAGCTTTTAGGAAATTATAGGTTGGCTAAAGG-3'），对编码斑点叉尾鮰LEAP2成熟肽区域的cDNA（mLEAP2）进行克隆（图1）。PCR反应体系如下：2.5 μL第一股cDNA、各4 μL 10 mol/L的正向和反向引物、1 μL Taq Plus DNA Polymerase（2.5 U/μL）、10 μL10×Taq Plus Buffer、8 μL 2.5 mmol/L dNTP，用无菌水将反应液调至100 μL。PCR反应条件如下：94℃预变性3 min，30个循环：94℃变性30 s、63℃退火30 s、72℃延伸1 min，最终72℃延伸5 min。PCR产物经DNA纯化试剂盒纯化后获得的目的片段“mLEAP”与pSURE-T Simple质粒载体按3∶1比例、在T4 DNA连接酶作用下，16℃连接过夜；转化至DH5α感受态细胞，37℃培养过夜；挑选阳性克隆进行DNA测序。

1.2.2 LEAP2成熟肽融合表达质粒的构建 将上述经DNA测序确证的、含pSURE-mLEAP2重组质粒的菌落经37℃、220 r/min液体培养过夜后，用质粒小提试剂盒抽提质粒；对得到的重组质粒进行EcoRI和Hind Ⅲ双酶切处理，反应体系和条件如下：10 μL pSURE-mLEAP2重组质粒、2 μL 10×M 缓冲液、1 μLEcoRI（20 U/μL）、1 μLHindⅢ（20 U/μL）、6 μL ddH2O；37℃保温3 h；经1%琼脂糖凝胶电泳后，切下目的片段进行DNA纯化。

同时，对pET-32a（+）表达质粒进行双酶切，反应体系如下：40 μL pET-32a（+）质粒、4 μL10×M缓冲液、2 μLEcoR I（20 U/μL）、2 μLHindⅢ（20 U/μL）、2 μL ddH2O；37℃保温4 h；经0.5%琼脂糖凝胶电泳后，切下线性质粒进行DNA纯化。

将上述含酶切位点的成熟肽片段mLEAP2与线性pET-32a（+）质粒按如下体系进行连接：1 μL 10×T4 DNA连接酶缓冲液、1 μL线性pET-32a（+）质粒、7 μL目的片段、1 μL T4 DNA连接酶；16℃连接过夜；连接液转化DH5α感受态细胞，37℃培养过夜；经PCR鉴定的阳性克隆进行DNA测序。

1.2.3 LEAP2成熟肽在大肠杆菌中的表达及表达产物的纯化 经测序确证的阳性菌落经液体培养后，进行质粒提纯；取1 μL pET32a-mLEAP2重组质粒转化E.coliBL21（DE3），筛选阳性菌落接种于含100 μg/mL氨苄青霉素的5 mL LB培养液中，37℃、220 r/min培养至OD600约为0.8；以1∶50的比例接种于含100 μg/mL氨苄青霉素的1 000 mL LB培养液中，同上培养至OD600约为0.6-0.8；然后，加入终浓度为0.7 mmol/L的IPTG，在25℃，110 r/min进一步培养16 h。培养液中均加入终浓度为1%的葡萄糖以减少目的蛋白的本底表达水平。通过低温离心（8 000 r/min、4℃、10 min）收集菌体，用预冷的PBS（140 mmol/L NaCl、2.7 mmol/L KCl、10 mmol/L Na2HPO4、2 mmol/L KH2PO4，pH7.3）重悬菌体，对菌体进行超声破碎后，再低温离心（12 000 r/min、4℃、10 min）收集上清和沉淀，分别进行Tricine-SDS-PAGE电泳分析，浓缩胶浓度4%，分离胶浓度10%，含0.1% SDS和0.1 mol/L Tricine。电泳结束后用0.1%的考马斯亮蓝R-250对凝胶进行染色，用25%的甲醇和7%的醋酸混合液脱色。

先使用Bio-Scale Mini Profinity IMAC Cartridges对上清进行固化金属离子亲和层析（IMAC），然后通过Bio-Scale Mini Bio-Gel P-6 Desalting Cartridges进行脱盐，得到纯化的融合蛋白trxA-mLEAP2，对其进行Tricine-SDS-PAGE分析。

1.2.4 基于LEAP2氨基酸序列的分子系统树构建分子系统树采用MEGA5.05邻位相联法（Neighbor-Joinging）构建，各结点的置信度由自引导值估计，重复次数为1 000。用于构建分子系统树的LEAP2全长氨基酸序列来自于NCBI网站，它们的序列号分别为：斑点叉尾鮰（Ictalurus punctatus，ID：NM_ 001200205）、长鳍叉尾鮰（Ictalurus furcatus，ID：AAX45792）、黄颡鱼（Tachysurus fulvidraco，ID：ACT33044）、虹鳟鱼同工型A（Oncorhynchus mykissA，ID：AAR11766）、虹鳟鱼同工型B（Oncorhynchus mykissB，ID：AAR11767）、牙鲆（Paralichthys olivaceus，ID：ACB97648）、人（Homo sapiens，ID：NP_ 443203）、 家 鼠（Mus musculus，ID：NP_694709）、东非狒狒（Papio anubis，ID：NM_001168764）、热带爪蟾（Xenopus laevis，ID：NM_001112914）、挪威大鼠（Rattus norvegicus，ID：NM_001126081）、原鸡（Gallus gallus，ID：NM_001001606）。

2 结果

2.1 斑点叉尾鮰成熟肽基因的cDNA序列及推断的氨基酸序列

以斑点叉尾鮰肝脏的第一股cDNA为模板、以MLF和MLR为引物，扩增得到一个126 bp的片段（图2）。测序结果（图3）表明该片段的两端分别引入了EcoR I和HindⅢ两个酶切位点；除去酶切位点后，该片段编码了一段由41个氨基酸残基组成的LEAP2成熟肽部分，4个保守的半胱氨酸残基位于该区域内。

2.2 斑点叉尾鮰LEAP2成熟肽一级结构的氨基酸序列分析及与其他生物的比较

采用Clustal W软件对斑点叉尾鮰LEAP2成熟肽与其他鱼类、哺乳动物和两栖动物等的LEAP2成熟肽一级结构进行分析和比对，结果（图4）显示，不同来源成熟肽的氨基酸序列显示了14个保守的氨基酸残基（灰色阴影和黑色方框），其中包括与LEAP2抗菌活性有关的4个高度保守的半胱氨酸残基（黑色方框）。斑点叉尾鮰mLEAP2与长鳍叉尾鮰之间显示了最高的序列同源性，为100%；与黄颡鱼之间的同源性略低，为98%；与斑马鱼、虹鳟2个同工型以及牙鲆之间的同源性为63%-85%。斑点叉尾鮰与哺乳动物之间显示了低的氨基酸序列同源性。

2.3 基于LEAP2氨基酸序列的分子系统树分析

由图5可见，分子系统树分为两大组，一组是鱼类，另一组是其他物种。鱼类组中斑点叉尾鮰与长鳍叉尾鮰显示了最近的亲缘关系，它们一起形成了由自引导值91支持的一个小分支。系统树分析结果与mLEAP2氨基酸序列比对的结果是一致的。

2.4 重组融合表达质粒的构建与鉴定

重组融合表达质粒pET32a-mLEAP2的构建如图6所示。通过菌落PCR鉴定，发现在近800-900 bp处有清晰条带（图7），与理论相符，初步确定为阳性菌落，经DNA测序证明目的片段mLEAP2已正确连接到pET-32a（+）表达载体上，并且核苷酸序列未发生任何碱基突变。

2.5 mLEAP2在E.coli BL21（DE3）中的融合表达及纯化

重组融合表达质粒pET32a-mLEAP2转化至E.coliBL21（DE3）后，经IPTG诱导培养16 h后，对菌体总蛋白和经超声破碎后的细胞上清及沉淀进行Tricine-SDS-PAGE分析。由图8可见，与各种对照（泳道1、3、4）相比，含pET32a-mLEAP2的诱导菌的总蛋白（泳道2）在近26 kD处有明显的条带，与trxA-mLEAP2融合蛋白的理论分子量相符；此外，该菌体细胞经超声破碎离心后得到的上清（泳道5）及沉淀（泳道6）中都显示了目的条带，表明trxA-mLEAP2融合蛋白除了以可溶性的形式表达之外，还存在于包涵体中。

对超声破碎后的上清先进行固化金属离子亲和层析（IMAC），然后通过Bio-Scale Mini Bio-Gel P-6 Desalting Cartridges进行脱盐，得到纯化的trxA-mLEAP2融合蛋白，其Tricine-SDS-PAGE分析结果如图9所示，在近26 kD处有清晰的条带。

3 讨论

哺乳动物的mLEAP2第29-32位有一个碱性氨基酸簇“-RKRR-”，第19-22位有一个酸性氨基酸簇“-DDSE-”，这两段保守的氨基酸簇被推测有助于LEAP2分子间的相互作用以及与细菌细胞膜的作用［11］。而斑点叉尾鮰和一些其他鱼类在这两个相应的位置所对应的序列是“-RKGH-”和“-NNYE-”，关于鱼类LEAP2抑菌机理的研究报道甚少。虽然来自不同生物的LEAP2氨基酸序列之间存在差异，但在它们羧基端区域均存在4个高度保守的半胱氨酸残基，证明在空间结构上由此形成的二硫键与LEAP2的抗菌活性有关［9］。

通常稀有密码子会影响目的基因在原核系统中的表达。当同一种氨基酸可由多个密码子编码时，大肠杆菌总是频繁使用某一个或几个密码子而几乎不使用其他的密码子，后者对于大肠杆菌来说就是稀有密码子。本文表达的LEAP2成熟肽氨基酸对应的41个密码子中含有10个稀有密码子，并且第25-27位密码子为3个连续的稀有密码子“ACG、GGA、AUA”，理论上可能会影响LEAP2的表达产量。由于未作密码子优化的对比试验，具体结论还有待验证。

本研究选择pET-32a（+）作为原核表达载体，该载体使目的基因的转录和翻译处于T7噬菌体信号控制之下，只有加入IPTG诱导剂后才能产生大量T7RNA聚合酶，从而使外源目的蛋白得以表达，因此，在加入诱导剂之前可以保证工程菌生长良好，有效防止了工程菌的自杀行为。pET-32a（+）携带有助于提高溶解性的硫氧还蛋白“trxA”编码序列，与目的蛋白基因形成融合基因，进而表达融合蛋白；另一方面，为提高表达产物的可溶性，选择了较低的表达温度25℃，结果表明确实获得了一定量的可溶性目的蛋白。但抑菌试验结果表明纯化的融合蛋白未显示明显的抑菌活性，其原因可能与trxA 融合头的存在有关，因其影响了产物的折叠，进而影响了生物学功能［9］。trxA 融合头的羧基端含有肠激酶识别位点，可望通过融合头的切除，获得具生物学活性的LEAP2成熟肽。该项工作目前正在进行中。

4 结论

从斑点叉尾鮰肝脏中克隆到编码LEAP2成熟肽的基因mleap2，该基因编码的成熟肽由41个氨基酸残基组成；4个高度保守的半胱氨酸残基位于成熟肽的羧基端区域。以pET-32a（+）为表达质粒，成功构建融合表达质粒pET32a-mLEAP2，转化至工程菌E.coliBL21（DE3）后，在25℃下，经0.7 mmol/L IPTG诱导培养16 h后，成功表达了“trxA-mLEAP2”融合蛋白。

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（责任编辑 李楠）

Fusion Expression of Channel Catfish（Ictalurus punctatus）LEAP2 Mature Peptide in Escherichia coli

Gao Bei Tao Yan
（College of Food Science and Technology，Shanghai Ocean University，Shanghai 201306）

Antimicrobial peptides generally are some small molecule peptides with strong ability to fight against microbial organisms. They play an important role in the host’s immune system and are considered to be good substitutes for traditional antibiotics. A cDNA fragment（mLEAP2）encoding the LEAP2（liver-expressed antimicrobial peptide 2）mature peptide consisted of 41-amino-acid was cloned from the liver of channel catfish（Ictalurus punctatus）by RT-PCR. When the amino acid sequence of channel catfish mLEAP2 was compared with those of poikilothermal fish and other species, fourteen residues were observed at conserved positions, especially four highly conserved cysteine residues occurred at C-terminal regions of these mLEAP2s, suggesting that two disulfide bridges resulted from these four cysteines possibly related to antimicrobial activity of LEAP2. Subsequently, themLEAP2gene was fused with atrxApartner gene with a 6×His-tag and an enterokinase site to construct the recombinant expression plasmid pET32a-mLEAP2. The fusion protein “trxA-mLEAP2” was successfully expressed inE .coliBL21（DE3）at 25℃ after a 16 h induction with 0.7 mmol/L IPTG. Tricine-SDS-PAGE showed that the fusion protein existed in both the supernatant and inclusion body after sonication and centrifugation. The purified fusion protein was successfully obtained by immobilized metal affinity chromatography（IMAC）.

Channel catfish LEAP2 mature peptide RT-PCR Fusion expression

2013-08-08

上海市教育委员会重点创新基金项目（11ZZ148）

高北，女，硕士研究生，研究方向：水产生物分子生物学；E-mail：wintergb@hotmail.com

陶妍，女，教授，硕士生导师，研究方向：水产生物分子生物学；E-mail：ytao@shou.edu.cn