长白山林蛙输卵管糖蛋白ROGP-III的分离纯化及鉴定

李稼晖 刘回民 赵宏宇 刘景圣

（吉林农业大学食品科学与工程学院，长春 130118）

长白山林蛙输卵管糖蛋白ROGP-III的分离纯化及鉴定

李稼晖 刘回民 赵宏宇 刘景圣

（吉林农业大学食品科学与工程学院，长春 130118）

通过正交试验确定最佳的粗提工艺，并将林蛙输卵管水提液先后通过盐析，透析，阴离子交换层析、阳离子交换层析和葡聚糖凝胶过滤层析，获得了一种分子量大小约为66 kD的单一蛋白，高碘酸-Schiff试剂法鉴定其为糖蛋白。经HPLC分析，纯度为97.2%，将其命名为ROGP-III，经PNGase F糖苷肽酶处理后推测其糖含量约为17%。

林蛙油 糖蛋白 分离 纯化 鉴定

输卵管分泌的黏性糖蛋白对脊柱动物的生殖功能有着不可替代的作用［1］。国内外关于哺乳动物输卵管糖蛋白分离纯化及免疫组化的研究逐渐增多［2-6］，而对林蛙输卵管糖蛋白的分离纯化及结构鉴定的研究鲜有报道。

中国林蛙（Rana chensinensis），又称雪蛤，属于两栖纲无尾目蛙科，主要生长在我国东三省的长白山、松花江等森林地区［7］。 新鲜林蛙输卵管经加工干制即为林蛙油，药理作用主要有抗疲劳、增强机体免疫力、镇咳祛痰、抗衰老、滋阴养颜、调节血脂、抗缺氧、调节机体免疫功能和应激性及抗焦虑等［8-11］。多数研究证实，林蛙油中的水溶性糖蛋白对林蛙油的功能性起到重要的作用［12-14］。但是，关于林蛙油中单一蛋白的功能研究尚无报道，而获得单一的林蛙输卵管糖蛋白是该研究方向的基础。

蛋白质的分离纯化方法较多，但都以蛋白质的溶解性，分子大小，带电荷数，疏水性大小，对配体的亲和特异性等差异作为理论基础进行分离［15-20］。由于林蛙输卵管蛋白种类繁多，分子量分布较密集，且大多为黏稠的糖蛋白，许多性质都较接近，因此在其分离纯化过程中难度较高，需要多种方法结合使用。在纯化策略上，整个分离纯化过程应该按照分离精确度从低到高，得率从高到低的顺序进行，以保证获得率最高，纯度最好的单一蛋白。因此，本试验按照粗提后先后使用硫酸铵分级盐析，透析袋透析，离子交换层析和Sephadex G-75凝胶过滤层析的结合，分离纯化得到一种林蛙输卵管糖蛋白并检测了纯度，酶法鉴定其糖基含量。

1 材料与设备

1.1 材料

1.1.1 原料与耗材 原料，长白山地区冬眠期雌性林蛙（3-5年龄）输卵管；柱料，DEAE Sepharose CL-6B Fast Flow 17-0709-01，CM Sepharose CL-6B Fast Flow 17-0719-01，Sephadex G-75 Superfine 17-0051-01；透析袋，截留范围6-8 kD。

1.1.2 试剂与仪器 试剂：考马斯亮蓝R250，考马斯亮蓝G250，Schiff试剂，标准蛋白Marker，PNGase F购于 Sigma生物公司；三羟甲基氨基甲烷、丙稀酰胺、N，N亚甲基双丙稀酰胺、过硫酸铵、十二烷基硫酸钠、L-甘氨酸、硫酸铵、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾均为国产分析纯。

仪器：蛋白层析仪AKTA prime plus，电泳仪EPS 301，低速离心机 LD5-2B，高速低温离心机FRESCO 17，手掌离心机 LX-100，pH计 雷磁PHS-3C分析天平 AUY220，真空抽滤机 AP-01P，金属浴K20，真空冷冻干燥机LGJ-18S。

1.2 方法

1.2.1 水溶性蛋白的分离 采取反复冻融法提取林蛙输卵管水溶性蛋白，使用Bradford法测定蛋白含量。经单因素试验及正交试验，确定最佳的方法为：取排卵前林蛙输卵管组织用0.7%的盐水洗去蛙血，剪成1 cm左右的小段，于0.05 mol/L PBS中浸泡12 h，使组织充分吸水膨胀，反复冻融破碎细胞3次后常温静置提取50 min，离心取上清液。

1.2.2 单一蛋白的纯化

1.2.2.1 硫酸铵分级沉淀 使用固体硫酸铵粉末沉淀粗蛋白，至溶液达到35%饱和度，充分搅拌30 min，4 000 r/min离心30 min，取出上清继续加入硫酸铵，使其达到40%饱和度，再次离心，以此类推，直至不再出现沉淀，将不同饱和度沉淀的蛋白分装收集。

1.2.2.2 透析 将沉淀蛋白用低浓度Tris-HCl缓冲液复溶，装入截留范围为6-8 kD的透析袋，于十倍体积的缓冲液中（pH 9.0的0.05 mol/L Tris-HCl）透析除盐。重复透析3-4次，每次6 h。重复富集此步样品，用抽真空冷冻干燥剂冻干后-80℃保存备用。

1.2.2.3 离子交换层析 用Tris-HCl缓冲液（0.02 mol/L，pH9.0）平衡DEAE-Sepharose阴离子交换柱至蛋白层析仪显示基线平稳，用含NaCl浓度梯度升高的Tris-HCl缓冲液分步洗脱，收集流穿峰和各洗脱峰，浓缩后用Tris-HCl缓冲液（0.02 mol/L，pH 5.5）透析。再用Tris-HCl缓冲液（0.02 mol/L，pH 6.0）平衡CM Sepharose阳离子交换柱，加入上一步中含有目的蛋白的浓缩液，用平衡液作为流动相，收集流穿峰。上样过程控制流速为2 mL/min，洗脱过程为1 mL/min，下同。

1.2.2.4 凝胶过滤层析 将上一步获得的样品浓缩并透析调整pH至8.0，通过用PBS缓冲液（0.05 mol/L，pH8.0）平衡的Sephadex G-75 Superfine凝胶过滤柱，用含0.02 mol/L NaCl 的PBS缓冲液（0.05 mol/L，pH8.0）洗脱，用自动收集器收集，记录管号，并对每管中的样品进行蛋白组分和多糖组分测定，蛋白直接测定A280，多糖用苯酚-硫酸法处理后，检测A490。

1.2.3 纯度测定 将纯化后的样品过膜后使用Agilent 1200高效液相色谱分析其纯度，条件如下：柱型号：ZORBAX 300SB-C18；检测波长：280 nm；进样量：20 μL；流动相：10%-50%乙腈+0.02 mol/L Tris-HCl+0.01 mol/L NaCl，pH 7.4；流速：1 mL/min；柱温：25℃。

1.2.4 ROGP-III的糖含量测定 将获得的单一糖蛋白调整浓度至1 mg/mL，取4 μL样品与4 μL1%的SDS溶液混合，90℃加热3 min，再按顺序加入8 μL 200 mmol/L Hepes（pH8.6），8 μL3.3% 的nonidet P-40，3 μL PNGase F，37℃过夜，SDS-PAGE鉴定。

2 结果与分析

2.1 林蛙输卵管蛋白粗提

在单因素基础上，对林蛙输卵管蛋白粗提取的正交试验结果如表1表2所示（均为4 g组织）。

由表可知，最优条件为A1B2C3D3，即：固液比为1∶4，浸泡时间为12 h，反复冻融次数为3次，提取时间为50 min。

对粗提液进行SDS-PAGE电泳，分别考马斯亮蓝R-250蛋白染色和高碘酸-Schiff试剂糖染色，结果如图1所示，林蛙输卵管蛋白多为糖蛋白。

2.2 林蛙输卵管糖蛋白的分离纯化

2.2.1 硫酸铵分级沉淀 由图2可知，随着硫酸铵饱和度的提高，各种蛋白被沉淀分离出来的程度不同，其中分子量约为66 kD的蛋白在硫酸铵饱和度达到60%时才有显著沉淀，说明此蛋白的亲水性较强，极有可能与其糖基的存在有关。有文献［21，22］证实非洲爪蟾及中华大蟾蜍输卵管中，分子量约为66 kD的糖蛋白对其卵黄膜发育过程中受精通道的形成起着至关重要的作用，因此林蛙输卵管中对应分子量大小的糖蛋白是否有相似的作用是值得研究的。此外，量最高的ROGP-I及ROGP-II本实验室均已做过研究并命名。因此，本研究将分子量约为66 kD的蛋白作为纯化的目的蛋白。

2.2.2 阴离子交换层析 将含有目的蛋白的硫酸铵沉淀复溶，经透析除盐后，用含不同浓度NaCl的缓冲液洗脱图谱如图3所示，其中P1峰为流穿峰，P2为0.5 mol/L NaCl洗脱，P3为1 mol/L NaCl洗脱，P4为1.5 mol/L NaCl洗脱。由SDS-PAGE电泳鉴定（图4），目标蛋白主要存在P4峰中，目标蛋白在经过DEAE-Sepharose离子交换层析后纯度大幅度提高。

2.2.3 阳离子交换层析 将上述样品浓缩透析后经CM Sepharose阳离子交换层析柱，收集流穿峰，浓缩透析后SDS-PAGE电泳结果（图5）显示，分子量约为112 kD的杂蛋白基本被完全除去，44 kD到66 kD之间的杂蛋白含量也显著降低。约42 kD的杂蛋白含量仍较高，将进一步使用Sephadex G-75 Superfine进行纯化。

2.2.4 葡聚糖凝胶过滤层析及糖蛋白鉴定 图6可以看出，P1的糖峰与蛋白峰重叠。P1经SDS-PAGE电泳分析（图7），可以看出目的蛋白存在P1峰中，结合图1可以确定该蛋白为糖蛋白。经高效液相色谱法检测，其纯度为97.2%，由此可知，目的蛋白已经得到了良好的分离纯化，将其命名为ROGP-III。

2.3 ROGP-III的含糖量测定 将经过PNGase F处理的纯品ROGP-III进行SDS-PAGE电泳（图8），其分子量由约66 kD下降至约55 kD，由此初步认为其糖链的分子量约为总分子量的17%。

3 结论

林蛙输卵管组织经反复冻融法粗提的总蛋白，先后使用硫酸铵分级盐析，透析袋透析，DEAESepharose阴离子交换层析，CM Sepharose 阳离子交换层析，Sephadex G-75 凝胶过滤层析，获得了分子量约为66 kD的单一蛋白ROGP-III，经高碘酸-Schiff试剂糖染色及凝胶过滤层析过程中苯酚-硫酸法测得的糖与蛋白吸光度重叠峰鉴定为糖蛋白，经HPLC分析其纯度为97.2%，酶法测定了其糖链含量约为17%。

将进一步对其进行动物食用功能性试验，对受精作用影响研究，N端氨基酸测序以及氨基酸组分测定，调取其基因并克隆表达，开展对林蛙油的分子生物学研究。

［1］ 徐庆勇, 陈清轩. 输卵管素（Oviductins）的研究进展［J］. 生物工程进展, 2001, 21（5）：45-47.

［2］ Boice ML, Geisert RD, Blair RM, et al. Identification and characterization of bovine oviductal glycoproteins synthesized at estrus［J］. Biology of Reproduction, 1990, 43（3）：457-465.

［3］ Oliphant G, Ross PR. Demonstration of production and isolation of three sulfated glycoproteins from the rabbit oviduct［J］. Biology of Reproduction, 1982, 26（3）：537-544.

［4］ Rapisarda JJ, Mavrogianis PA, O'Day-Bowman MB, et al. Immunological characterization and immunocytochemical localization of an oviduct-specific glycoprotein in the human［J］. Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism, 1993, 76（6）：1483-1488.

［5］ Avilés M, Gutiérrez-Adán A, Coy P. Oviductal secretions：will they be key factors for the future ARTs?［J］. Molecular Human Reproduction, 2010, 16（12）：896-906.

［6］ Pradeep MA, Jagadeesh J, De AK, et al. Purification, sequence characterization and effect of goat oviduct-specific glycoprotein in vitro embryo development［J］. Theriogenology, 2011, 75（6）：1005-1015.

［7］ 张根生, 范爱月, 韩冰, 等. 响应曲面法优化碱性蛋白酶提取林蛙残体胶原蛋白［J］. 食品科学, 2011, 32（2）：93-93.

［8］ 胡鑫, 刘成柏, 陈晓平, 等. 林蛙油中主要营养保健成分含量的研究［J］. 吉林农业大学学报, 2003, 25（2）：218-220.

［9］ 牛艳秋. 中国林蛙药理作用的研究进展［J］. 长春医学, 2009, 7（2）：72-73.

［10］ 曲保忠, 张建, 钟秀宏, 等. 林蛙油复方冲剂对X线所致大鼠脾脏损伤的影响［J］. 时珍国医国药, 2013, 1（1）：85-86.

［11］ 马艳梅, 陈晓平. 林蛙油蛋白水解营养液的研究［J］. 食品与药品, 2011, 13（11）：421-423.

［12］ 陈晓平, 崔敬爱, 胡耀辉. 林蛙油主要营养成分的研究［J］.食品科学, 2005, 26（8）：361-363.

［13］ 杜景新, 王丽, 李春慧. 林蛙油, 林蛙卵油的成分及开发利用［J］. 人参研究, 2003, 3（1）：18-19.

［14］ 李东风, 陈伟庭. 中国林蛙研究进展［J］. 辽宁师范大学学报：自然科学版, 2005, 28（1）：92-94.

［15］ 隗啸南, 高金燕, 李欣, 等. 花生过敏原蛋白分离纯化方法研究进展［J］. 食品科学, 2011, 32（17）：371-375.

［16］ 张唐伟, 李天才. 藻胆蛋白质的提取纯化与生物活性研究进展［J］. 生物技术通报, 2010（1）：9-13.

［17］ 王炳楠, 杨秀芬, 曾洪梅, 等. 大丽轮枝菌分泌蛋白激发子的分离纯化及生物功能研究［J］. 生物技术通报, 2011（11）：166-171.

［18］ Ziğal N, Akdoğan E, Mutlu M. Membrane surface modification for protein separation：amphoteric surfaces by plasma polymerization［J］. Curr Opin Biotechnol, 2011, 1（22）：62-63.

［19］ Singh H, LeBowitz JH, Baldwin Jr AS, et al. Molecular cloning of an enhancer binding protein：isolation by screening of an expression library with a recognition site DNA［J］. Cell, 1988, 52（3）：415-423.

［20］ Capriotti AL, Cavaliere C, Foglia P, et al. Intact protein separation by chromatographic and/or electrophoretic techniques for top-down proteomics［J］. J Chromatogr A, 2011, 1218（49）：8760-8776.

［21］ Lindsay LAL, Wieduwilt MJ, Hedrick JL. Oviductin, the Xenopus laevis oviductal protease that processes egg envelope glycoprotein gp43, increases sperm binding to envelopes, and is translated as part of an unusual mosaic protein composed of two protease and several CUB domains［J］. Biol of Reprod, 1999, 60（4）：989-995.

［22］ Hiyoshi M, Takamune K, Mita K, et al. Oviductin, the oviductal protease that mediates gamete interaction by affecting the vitelline coat in bufo japonicas - its molecular cloning and analyses of expression and posttranslational activation［J］. Developmental Biology, 2002, 243（1）：176-184.

（责任编辑 狄艳红）

Separation and Identification of Oviduct Glycoprotein ROGP-III from Rana chensinensis

Li Jiahui1Liu Huimin Zhao Hongyu Liu Jingsheng
（College of Food Science and Engineering, Jilin Agricultural University，Changchun 130118）

To study the function of the single glycoprotein in Rana chensinensis, this research determined the best coarse extraction process by orthogonal test, then purified a 66 kD single protein by salting out, dialysis, ion-exchange column chromatography and gel filtration chromatography. The purified protein identified as glycoprotein by PAS test. By HPLC identification, its purity is 97.2%, named as ROGP-III, after enzymolysis by PNGase F, it speculated that the polysaccharide content is about 17%.

Oviducts Rana Glycoprotein Separation Purification Identification

2013-09-09

国家自然科学基金项目（30671536）

李稼晖，男，硕士，研究方向：食品生物化学与功能性食品；E-mail：lijiahuizml@gmail.com

刘景圣，男，博士，教授，研究方向：功能性食品；E-mail：liujs1007@vip.sina.com