农杆菌介导亚洲百合转化体系的建立及转GsZFP1基因研究

张焕郑佳阚丹丹樊金萍

（1.东北农业大学园艺学院，哈尔滨 150030；2.伊春市南岔区人事局，153000 伊春；3.黑河市爱辉区纪检委，黑河 164300）

农杆菌介导亚洲百合转化体系的建立及转GsZFP1基因研究

张焕1郑佳2阚丹丹3樊金萍1

（1.东北农业大学园艺学院，哈尔滨 150030；2.伊春市南岔区人事局，153000 伊春；3.黑河市爱辉区纪检委，黑河 164300）

以亚洲百合‘耀眼’（Cedeazzle）无菌苗小鳞片为遗传转化受体，并利用农杆菌介导法将锌指转录因子基因GsZFP1转化‘耀眼’无菌苗小鳞片，初步建立亚洲百合‘耀眼’的遗传转化体系，通过筛选获得了50株疑似转化植株，通过用PCR方法对获得的50株疑似抗性植株进行检测，结果显示20株呈阳性，PCR阳性转化率为40%；将得到的阳性植株进行RT-PCR检测，获得12株RT-PCR阳性植株。结果表明，锌指转录因子基因GsZFP1在亚洲百合‘耀眼’中得到表达。

亚洲百合 鳞片 转化体系 农杆菌介导 GsZFP1基因

百合（Liliumspp.）是世界著名鲜切花，消费量逐年攀升［1］，并且百合在花卉市场上占有重要位置［2］。由于东北地区多以亚洲百合栽培为主，为了进一步提高亚洲百合的抗寒、抗旱性，因此开展将抗性基因导入百合的研究对百合抗性品种筛选具有重要的指导意义。而百合遗传转化体系多以直接再生方式为主［3］，遗传转化中多采用农杆菌介导法。如刘菊华等［4］以鳞片为受体，通过农杆菌介导法将携带有几丁质酶基因和β-1，3葡聚糖酶基因导入百合，得到了转基因植株。陈莉等［5］以麝香百合‘White Elegance’叶片为受体，将Mn-SOD基因导入百合中，以直接再生为主产生抗性植株。因此，通过农杆菌介导法将抗性基因导入百合的研究是必要的。

锌指蛋白是目前发现种类最多、在真核细胞中具有重要调控作用的一类核酸结合蛋白［6］。它是一类具有指状结构域的转录因子，普遍存在于植物中，主要功能涉及植物的生长发育和对环境胁迫的应答反应［7-9］。它对生物的发育及逆境胁迫的耐受能力都有着重要关系［10］。目前植物研究较多、较为明确的锌指蛋白是C2H2型锌指蛋白，该蛋白大部分锌指结构具有一段高度保守的氨基酸序列 QALGGH，这是植物中独有的特征［11］。研究表明，超量表达C2H2类型的ZFPs不但提高了植物对盐、干旱及低温等非生物胁迫的耐性，还同时改变了下游基因表达及胁迫响应信号通路的传递［12-15］。GsZFP1基因的表达产物属于C2H2锌指蛋白。GsZFP1基因是罗晓等［16，17］首次从野生大豆中克隆出来的，并且经研究表明，该基因能提高拟南芥植株的耐干旱、耐冷性。

本试验用的植物表达载体pCEOM-GsZFP1带有CaMV35S启动子、E12增强子和 bar 筛选标记基因，CaMV35S启动子是广泛运用的组成型启动子，在植物中表达效率高［18］，bar基因不仅可以作为筛选标记基因使用，还具有农艺价值且是国家公认的安全性基因［19］。本研究通过农杆菌介导法将GsZFP1基因导入亚洲百合‘耀眼’（Cedeazzle），期待提高其对干旱及冷的抗性，为今后培育亚洲百合抗性品种奠定一定的理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 亚洲百合‘耀眼’（Cedeazzle）鳞茎，由东北农业大学园艺试验站温室提供。

1.1.2 菌株和质粒 大肠杆菌菌株DH5α、农杆菌GV3101均由东北农业大学园艺学院园林育种实验室提供；重组质粒pCEOM-GsZFP1由东北农业大学植物生物工程研究室提供。

1.1.3 常用试剂及酶类 DNA Marker DL2000、dNTPs、Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System均购自大连宝生物工程公司，PCR引物由哈尔滨博仕生物工程公司合成。

1.1.4 培养基和培养条件 试验各个阶段所用的最佳培养基组成及其编号，见表1，各培养基中均含3.0% 蔗糖和 0.7% 琼脂，pH为5.82，121℃灭菌 20 min；培养条件：温度为（25±1）℃、光照强度为25 μmol（m2· s）、光照周期为16 h。

1.2 方法

1.2.1 质粒DNA的提取及检测 采用中科瑞泰质粒小剂量提取试剂盒提取，提取重组质粒DNA后，进行PCR及凝胶电泳检测。

1.2.2 冻融法转化根癌农杆菌及检测 采用冻融法将质粒pCEOM-GsZFP1转入根癌农杆菌GV3101，先制备农杆菌GV3101感受态细胞，再将重组质粒转入农杆菌感受态细胞中，最后进行检测。

1.2.3 农杆菌介导亚洲百合‘耀眼’的遗传转化

1.2.3.1 转化受体材料的获得 剥取较厚大的亚洲百合‘耀眼’鳞片，先用流水冲洗40 min左右，再在超净工作台中经过一系列灭菌之后接种至M1培养基中，进行不定芽分化培养（图1-A）；当不定芽长至3-5 cm时从基部切下，接种至M2培养基上，先暗培养15 d，再取出置于组培室，进行试管鳞茎诱导培养（图1-B），培养45 d左右时，取试管鳞茎上较厚大的小鳞片接种至M3培养基上，进行预培养，5 d左右时即可进行侵染（图1-C）。

1.2.3.2 农杆菌侵染液的准备 先用接菌环挑取单菌落接种在10 mL含相应抗生素的YEB液体培养基中，于28℃，200 r/min振荡培养，至菌液OD600为0.5-0.6，约36 h；然后用接种环蘸取一次活化的菌液按1∶10的比例接种在50 mL添加相应抗生素的YEB液体培养基中二次活化，于28℃，200 r/min振荡培养，至OD600为0.5-0.6，约16 h；最后将菌液移至无菌离心管中于10 000 r/min离心10 min，弃上清，用等体积的MS液体培养基重悬，再振荡1-2 h，至OD600为0.5-0.6，即可作为侵染液备用。

1.2.3.3 筛选剂草丁磷（PPT）浓度的确定 选取试管鳞茎上生长厚大的小鳞茎，用刀片切成约0.25 cm2左右的小块，在侵染液（OD600为0.5-0.6）中侵染20 min，接种在附加不同浓度PPT（0、0.5、0.75、1.0、1.25、1.5、1.75、2.0 mg/L）的分化培养基上，15 d继代一次，30 d后观察小鳞片不定芽分化情况；选取分化较好的不定芽从基部切下，接种在附加不同 浓 度PPT（0、0.25、0.5、0.75、1.0、1.25、1.5 mg/L）的生根培养基上，25 d后观察生根情况。

1.2.3.4 抑菌剂头孢霉素（Cef）浓度的确定 本试验选用头孢霉素（Cef）作为抑菌剂，用接种环把农杆菌GV3101在附加不同浓度Cef的YEB固体培养平板上划线，放置在培养箱内进行28℃暗培养，2-3 d后观察抑菌效果，初步确定抑菌剂的大致浓度。再进一步做外植体敏感性试验。将转化受体材料（小鳞片）在侵染液（OD600为0.5-0.6）中浸泡15-20 min，取出材料并用无菌滤纸吸干，接种到含有不同浓度（0、150、200、250、300、350、400 mg/L）Cef除菌筛选培养基上，15-20 d继代一次，随时观察Cef的抑菌效果对小鳞片分化的影响，培养40 d后统计分化情况。

1.2.3.5 农杆菌最适侵染时间的确定 将外植体侵染时间设为5、10、15、20、25、30 min 6个梯度。用准备好的农杆菌侵染液侵染预培养5 d的‘耀眼’小鳞片，然后将其接种至M3培养基上，共培养3 d左右时，取出接种至M4培养基上进行不定芽分化，培养一段时间后，将分化的不定芽从基部切下，接种至M5培养基上进行生根培养，观察记录其生长状况。

1.2.4 转基因植株的分子检测

1.2.4.1 转基因植株的PCR检测 用CTAB法提取转化后获得的抗性植株叶片DNA，以叶片DNA为模板，以植物表达载体上Bar-35S启动子序列特异引物进行PCR检测。

1.2.4.2 PCR阳性植株的RT-PCR检测 提取经PCR检测阳性植株及非转基因植株的总RNA，首先将其反转录，然后以反转录产物为模板，对转GsZFP1基因阳性植株进行RT-PCR检测，以检测目的基因在转录水平上的表达。

2 结果

2.1 大肠杆菌质粒DNA的提取及检测

提取重组质粒DNA后，进行PCR及凝胶电泳检测，电泳结果（图2）显示，转化质粒的阳性克隆扩增出目的条带。

2.2 质粒DNA转化根癌农杆菌及检测

首先采用冻融法将重组质粒pCEOM-GsZFP1转入农杆菌中，其次在含有相应抗生素的YEB培养基上划线，待有单个的菌落长出后，进行摇菌，最后对得到的菌液进行PCR检测。由电泳结果（图3）可以看出，扩增出目的条带，说明重组质粒已转入到根癌农杆菌中，可以用于下一步的转化。

2.3 农杆菌介导‘耀眼’的遗传转化

2.3.1 筛选剂草丁磷对外植体分化率的影响 经过不同浓度的草丁磷筛选试验，30 d后观察可知，小鳞片随着草丁磷浓度的上升分化率明显降低（图4），统计数据发现草丁磷浓度为1.0 mg/L时，‘耀眼’小鳞片的分化率明显降低，为38.34%；草丁磷浓度为1.5 mg/L时，‘耀眼’小鳞片的分化率急剧下降，为8.34%；当草丁磷浓度为1.75 mg/L时，‘耀眼’小鳞片的分化率为3.33%，鳞片已经不能分化出健康的不定芽（表2）。因此，以鳞片作为转基因受体分化不定芽时，筛选剂草丁磷浓度以1.75 mg/L为宜。

由表3可知，不定芽根的分化随着草丁磷浓度的上升分化率明显降低。统计数据发现草丁磷浓度为0.75 mg/L时，根的分化率明显降低，为36.67%；草丁磷浓度为1.0 mg/L时，根的分化率急剧下降，为17.50%；当草丁磷浓度为1.25 mg/L时，根的分化率为4.27%，不定芽已经不能分化出健康的根。因此，当转基因不定芽分化根时，筛选剂草丁磷浓度以1.25 mg/L为宜。

2.3.2 抑菌剂头孢霉素（Cef）浓度的确定 经初步筛选确定了抑菌剂的大概浓度为300 mg/L，然后在除菌筛选阶段，以300 mg/L为基准再分别上下设定不同的浓度进行处理，1周后观察效果（表4）。Cef 在300-350 mg/L范围内能有效抑制农杆菌的生长，当Cef浓度为300 mg/L时，外植体的分化率为78.34%，相对较高；而当Cef浓度为350 mg/L时，外植体的分化率为41.67%，分化率相对较低。本着筛选不抑制植物生长的最大浓度的原则，确定‘耀眼’转化抑菌剂浓度为300 mg/L。外植体不定芽长至3-5 cm 时，从基部切下，在300 mg/L浓度的抑菌剂溶液中冲洗一下，并用滤纸吸干，再接种至无菌苗生根培养基中。

2.3.3 农杆菌侵染时间对‘耀眼’转化率的影响 由表5可知，侵染时间为5-10 min时，分化率较低；侵染时间为25-30 min时，褐化率较高，除菌较困难；侵染时间为.15-20 min时，外植体分化率较高，长势较好，易除菌。其中侵染时间为20 min时，分化率最高且长势好。因此，‘耀眼’无菌苗小鳞片最适宜的侵染时间为20 min。

2.3.4 亚洲百合‘耀眼’遗传转化以及抗性植株再生 农杆菌介导亚洲百合‘耀眼’转化及抗性植株再生的过程如图5所示，首先对预培养的小鳞片进行侵染（5-A）、预培养（5-B）；其次进行抗性芽的筛选（5-C）及芽伸长培养（5-D）；然后进行抗性苗的生根筛选（5-E，F）；最后进行移栽，获得转基因植株（5-G）。

2.4 ‘耀眼’转基因植株的分子检测

2.4.1 转基因植株的PCR检测 对筛选出的50株疑似抗性植株进行PCR检测，用Bar-35S启动子序列特异引物，以质粒为阳性对照，水为阴性对照，非转基因植株为负对照对转基因植株进行初步的筛选。经初步检测，在试验得到的50株疑似转基因植株中，共得到20株PCR阳性植株，PCR阳性转化率为40%，初步证明锌指转录因子基因GsZFP1已转入到亚洲百合‘耀眼’中。部分检测结果见图6。

2.4.2 阳性植株的RT-PCR检测 为进一步检测GsZFP1在转基因植株中的表达情况，进行RT-PCR检测。经检测，筛选到的20株PCR阳性植株中，有12株为RT-PCR阳性植株，说明基因GsZFP1在这些植株中有成功转录的，但也有不转录的。部分检测结果见图7。

3 讨论

由于本试验所使用的植物表达载体pCEOMGsZFP1上带有bar 筛选标记基因，因此选用草丁磷为筛选剂。在之前亚洲百合转基因过程中，多数以卡那霉素及羧苄青霉素作为筛选剂，只有王凯等［20］在以亚洲百合‘金黄精灵’为受体材料，建立遗传转化体系的过程中，以草丁磷为筛选剂，并且得出芽分化阶段PPT浓度为1.6 mg/L，根分化阶段PPT浓度为0.8 mg/L。本研究通过筛选剂浓度梯度试验确定亚洲百合‘耀眼’芽分化阶段PPT最适的浓度为1.75 mg/L，根分化阶段PPT最适的浓度为1.25 mg/L。试验结果与前者不同，这说明亚洲百合不同品种在遗传转化的过程中，使用的筛选剂浓度也不同。

本试验对筛选植株进行了PCR检测和RT-PCR检测，初步证明GsZFP1基因已在亚洲百合‘耀眼’表达，但对于转基因‘耀眼’的抗旱性及耐冷性仍需进一步试验研究，包括对转基因植株进行基因表达水平的定量分析、基因表达对植株生理代谢的影响及遗传稳定性的表达等，以筛选出表达强、抗逆性提高幅度大且生长正常的转基因植株，为以后百合的抗性育种和推广应用奠定一定的理论基础。

4 结论

本研究以亚洲百合‘耀眼’无菌苗小鳞片为转化受体，以根癌农杆菌GV3103为转化的菌株，bar基因为筛选标记基因，CaMV35S为启动子，将GsZFP1基因导入亚洲百合‘耀眼’，建立亚洲百合‘耀眼’的遗传转化体系，通过筛选获得了50株疑似转化植株，用PCR方法对获得的50株疑似抗性植株进行检测，结果显示20株呈阳性，PCR阳性转化率为40%；将得到的阳性植株进行RT-PCR检测，获得12株RT-PCR阳性植株。结果表明锌指转录因子基因GsZFP1在亚洲百合‘耀眼’中得到表达。

［1］ 黄洁, 刘晓华, 管洁, 等.百合分子育种研究进展［J］.园艺学报, 2012, 39（9）：1793-1808.

［2］ 郭美, 刘雅莉, 王跃进, 等.亚洲百合试管苗生根移栽的研究［J］.西北林学院学报, 2010, 25（2）：76-79.

［3］ Haensch K T. Plant regeneration through somatic embryogenesis in different genotypes of Lilium hybrids［J］. Gartenbauwissenschaft, 1996, 61：214-218.

［4］ 刘菊华, 金志强, 徐碧玉. 野百合的植株再生与遗传转化［J］.分子植物育种, 2003, 1（4）：465-474.

［5］ 陈莉, 马颖, 马锋旺等.根癌农杆菌介导麝香百合遗传转化体系的建立［［J］. 西北植物学报, 2007, 27（7）：1335-1340.

［6］ 宋冰, 王丕武, 洪洋, 等. 大豆 C2H2型锌指蛋白的研究进展［J］.农业机械（油脂工程）, 2011（5）：81-84.

［7］ Vallee BL, Falchuk KH. The biochemieal basis of zinc physiology［J］. Physiology Reviews, 1993, 73（1）：79 -118.

［8］ Ciftci-Yilmaz S, Mittler R. The zinc finger network of plants［J］. Cellular and Molecular Life Sciences, 2008, 65：1150-1160.

［9］ Kubo K, Sakamoto A, Kobayashi A, et al. Cys2/His2 zinc-finger protein family of petunia：evolution and general mechanism of target sequence recognition［J］.Nucleic Acids Resea, 1998, 26（2）：608-615.

［10］ Ciftci-Yilmaz S, Mittler R. The zinc finger network of plants［J］. Cell Mol Life Sci, 2008, 65（7-8）：1150-1160.

［11］ LIli Tang, Hua Cai, Wei Ji, et al. Overexpression of GsZFP1 gene in transgenic alfalfa plants shows enhanced tolerance to salt and drought stresses［J］. Plant Physiology and Biochemistry, 2013（5）：81-84.

［12］ Davletova S, Schlauch K, Coutu J, et al. The zinc-finger protein Zat12 plays a central role in reactive oxygen and abiotic stress signaling in Arabidopsis［J］. Plant Physiol, 2005, 139：847-856.

［13］ Huang XY, Chao DY, Gao JP, et al. A previously unknown zinc finger protein, DST, regulates drought and salt tolerance in rice via stomatal aperture control［J］. Genes & Dev, 2009, 23：1805-1817.

［14］ Tsutsui T, Yamaji N, Feng MJ. Identification of a cis-acting element of ART1, a C2H2-type zinc-finger transcription factor for aluminum tolerance in rice［J］. Plant Physiol, 2011, 156：925-931.

［15］ Li C, Lv J, Zhao X, et al. TaCHP：A wheat zinc finger protein gene down-regulated by abscisic acid and salinity stress plays a positive role in stress tolerance［J］. Plant Physiol, 2010, 154：211-221.

［16］ 罗晓, 曹蕾, 王明超, 等.野生大豆盐碱胁迫响应基因GsZFP1的克隆及序列分析［J］.东北农业大学学报, 2012, 43（4）：20-26.

［17］ Luo X, Bai X, Zhu D, et al. GsZFP1, a new Cys2/His2-type zincfinger protein, is a positive regulator of plant tolerance to cold and drought stress［J］.Planta, 2012, 235：1141-1155.

［18］ Hauptman RM, Ozias AP, Vasil V, et al. Transient expression of electroporated DNA in monucotyledonous and dicotyledonous species［J］. Plant Cell Rep, 1987：6264-6272.

［19］ 贾士荣.转基因植物食品中标记基因的安全性评价［J］.中国农业科学, 1997, 30（2）：1-15.

［20］ 王 凯, 车代弟, 王金刚, 等. 百合遗传转化体系的建立［J］.东北农业大学学报, 2008, 39（5）：39-43.

（责任编辑 李楠）

Establishment of Agrobacterium-mediated Asiatic Lily‘Cedeazzle’Transformation System and Transfer of GsZFP1 Genes

Zhang Huan1Zheng Jia2Kan Dandan3Fan Jinping1
（1. College of Horticulture，Northeast Agricultural University，Harbin 150030；2. Personnel，Nancha area，Yichun 153000；3. JiJianWei，Aihui District，Heihe 164300）

With small scales of aseptic seedling as genetic transformation, zinc finger transcription factor gene GsZFP1 was transformed into‘Cedeazzle’aseptic small scales by Agrobacterium-mediated, and the genetic transformation system of Asiatic Lily‘Cedeazzle’was established. Fifty putative transgenic plants were obtained, and 20 were identified as positive transgenic plants by PCR assay, PCR transform rate was 40%；and 12 positive plants were obtained by RT-PCR test. The results showed that GsZFP1 was expressed in Asiatic Lily‘Cedeazzle’.

Asiatic lily Small scales Transformation system Agrobacterium-mediated GsZFP1 gene

2013-08-23

张焕，女，硕士研究生，研究方向：园林植物遗传育种；E-mail：ZHLQ8584@163.com

樊金萍，女，教授，研究方向：园林植物遗传育种；E-mail：fan_xuer2000@aliyun.com