利用SSR标记鉴定热研二号油绿苦瓜杂交种纯度

刘子记 詹园凤 杨衍

（中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所 农业部华南作物基因资源与种质创制重点开放实验室，儋州 571737）

利用SSR标记鉴定热研二号油绿苦瓜杂交种纯度

刘子记 詹园凤 杨衍

（中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所 农业部华南作物基因资源与种质创制重点开放实验室，儋州 571737）

利用SSR分子标记技术对热研二号油绿苦瓜进行杂交种纯度检测技术研究。研究结果表明，5对SSR标记在热研二号亲本间表现明显的多态性，其中4对为共显性标记，1对为显性标记。为确保鉴定结果的准确性和可靠性，利用4对共显性的SSR标记对热研二号进行纯度鉴定，杂交种纯度为98.82%，与田间形态学鉴定结果完全一致。该研究表明利用SSR标记对热研二号油绿苦瓜进行纯度鉴定是切实可行的。

苦瓜 SSR 热研二号 纯度鉴定

苦瓜（Momordica charantiaL.，2n= 2x= 22）为葫芦科（Cucurbitaceae）苦瓜属（MomordicaL.）一年生草本植物，因果实具有特殊的苦味，故名苦瓜。苦瓜营养价值很高，富含维生素C、维生素E、氨基酸及矿物质。此外，苦瓜所含的药理活性成分具有降血糖［1］、抗肿瘤［2］和降低胆固醇［3］等功效。海南省属于华南地区北运瓜菜产业带，对保障全国菜篮子工程建设具有不可替代性。苦瓜是海南主要冬种瓜菜种类之一，栽培面积逐年扩大。

作物杂交种纯度显著影响作物的产量和品质。开展种子纯度检测对保证种子质量和发挥优良品种的增产潜力具有重要意义。传统田间形态鉴定所需时间较长，易受环境条件影响，不能完全满足杂交种生产经营的需要［4］。DNA 分子标记技术的发展为作物品种鉴定与纯度分析提供了更为准确、可靠、方便的方法。SSR标记具有快速、准确、多态性丰富、呈共显性遗传、操作简单、结果稳定可靠等特点［5］，符合作物品种鉴别的4个基本准则：环境的稳定性、品种间变异的可识别性、最小的品种内变异和实验结果的可靠性。可以快速、准确、有效地检测生物体中的遗传变异，被广泛用于黄瓜［6，7］、甜瓜［8］、西瓜［9］等瓜类作物品种纯度检验。与黄瓜、西瓜和甜瓜相比，苦瓜基因组研究进展比较缓慢，公开发表的基因组序列资源和SSR标记数目非常有限，目前国内外尚无利用SSR标记鉴定苦瓜杂交种纯度的研究报道。本研究拟以热研二号油绿苦瓜杂交种及其亲本为材料，旨在利用SSR标记建立苦瓜杂交种纯度鉴定技术体系。

1 材料与方法

1.1 材料

热研二号属油绿型杂交苦瓜品种，由中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所选育而成，适合在华南地区的海南、广东、广西苦瓜主产区推广种植。母本材料02-20-4-9由来自日本冲绳省的一个栽培品种经过连续8代自交选育出的强雌性系，表现丰产、中熟、强雌性、高抗白粉病。父本MC009是来自云南玉溪的一个优良自交系，该自交系抗病性强，早熟。将热研二号、母本及父本材料播种于营养钵中，待植株长至5-6片真叶时利用改良的CTAB法［10］提取02-20-4-9、MC009和热研二号单株叶片的基因组DNA，贮于-20℃冰箱备用。

1.2 方法

1.2.1 多态性标记筛选 利用已开发的苦瓜SSR标记［11，12］，以母本材料02-20-4-9和父本材料MC009基因组DNA为模板进行扩增，筛选多态性的SSR标记。

PCR反应体系为10 μL，其中包括10 mmol/L Tris-HCl（pH8.0），50 mmol/L KCl，1.5 mmol/L MgCl2，0.15 mmol/ L dNTPs，50 ng引物，0.6 UTaqDNA聚合酶和60-100 ng模板DNA。扩增程序为94℃预变性3 min；94℃变性40 s，50-60℃（根据具体引物的退火温度而定）退火40 s，72℃延伸1.5 min，35个循环；72℃终延伸6 min。PCR产物保存于4℃。4 μL扩增产物与2 μL上样缓冲液混合经12%非变性聚丙烯酰胺（丙烯酰胺∶甲叉双丙烯酰胺=39∶1）凝胶电泳，银染显色进行带型统计。

1.2.2 热研二号杂交种纯度鉴定 利用在亲本材料间表现多态性的SSR标记，以热研二号油绿苦瓜单株DNA为模板进行扩增，根据特异谱带的扩增结果检测杂交种的纯度。将取材后的苦瓜幼苗按照顺序移栽到中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所蔬菜试验基地，在结果期依据品种的果皮颜色及果实特征特性逐株进行鉴定，将SSR标记鉴定结果与田间形态鉴定结果进行比较分析。

2 结果

2.1 材料DNA提取

在研磨苦瓜叶片时添加少量PVP能有效去除糖类物质，利用0.8%的琼脂糖凝胶电泳检测提取的DNA纯度和浓度，样品检测结果（图1）表明，DNA呈现一条清晰整齐的主带，无明显降解现象，符合SSR标记分析对DNA模板质量的要求。

2.2 多态性标记筛选

以母本材料02-20-4-9和父本材料MC009为模板筛选26对苦瓜SSR引物，其中15对引物能扩增出清晰可辨的条带，扩增效率为57.69%，5对引物在亲本间能扩增出明显的多态性（表1，图2），多态性比率为19.23%，BSSR3、BSSR7、BSSR9和BSSR14为共显性标记，扩增出的特异谱带能够将杂交种与母本自交种、父本自交种区分开来；BSSR16为偏父本型的显性标记，杂交种扩增出的谱带与父本材料一致；多态性片段大小150-480 bp（图2）。

2.3 利用SSR标记对热研二号杂交种纯度进行鉴定

共显性标记可以有效区分杂交种、母本自交种和父本自交种。本研究选用在亲本材料间表现共显性的标记BSSR3、BSSR7、BSSR9和BSSR14对170株热研二号油绿苦瓜进行扩增，扩增结果（图3）表明，168个热研二号单株具有双亲特异谱带，属于真实的杂交种，15号和26号单株缺少父本特异带，与母本扩增图谱一致，说明15号和26号单株为母本自交株，这可能由于雄花摘除不彻底导致母本自交结实致使杂交种中混有少量母本自交种，4对SSR标记的鉴定结果一致，热研二号杂交种纯度为98.82%。从分子标记鉴定结果来看，母本自交是降低杂交种纯度的主要原因。母本材料02-20-4-9来自日本冲绳省，表现强雌性，果实长圆锥形，浅绿色，父本材料MC009来自云南玉溪，条瘤粗直均匀，深绿色。

在田间鉴定中，通过观察果皮颜色和性别类型鉴定热研二号纯度。15号和26号单株果皮颜色为浅绿色，表现为强雌性系，其余植株均具有热研二号油绿苦瓜典型特征，植株生长旺盛，分枝性较强，果实长圆锥形，皮色深绿有光泽，瓜形美观，田间鉴定结果表明15号和26号单株属母本自交株，标记鉴定结果与田间鉴定结果完全一致。该研究结果表明SSR技术可用于热研二号油绿苦瓜杂交种纯度快速检测。

3 讨论

作物杂交种纯度田间种植形态鉴定所需周期较长，耗费大量人力、物力和财力，易受栽培措施及环境因素影响，另外鉴定者的观察经验也制约着鉴定的准确性。理想的鉴定技术不但要准确可靠，还要简单、快速和经济，这是品种纯度鉴定技术的发展趋势［13］。DNA分子标记技术的出现，为作物品种纯度鉴定提供了更为准确、可靠、方便的方法。近年来，AFLP、RAPD和SSR等分子标记技术被广泛用于作物杂交种纯度鉴定。张菊平等［14］和林珲等［15］利用RAPD分子标记分别对‘碧绿3号’和‘闽研2号’苦瓜杂交种进行纯度鉴定，标记鉴定结果与田间鉴定结果完全一致，但RAPD标记的稳定性和重复性较差。SSR标记技术不仅具有RFLP技术的稳定性和共显性的优点，而且操作简单和重复性较好，能够将真正的杂交种和自交株、混杂株区分开，是进行作物杂交种纯度鉴定的首选标记类型，已在多种农作物杂交种纯度鉴定中得到应用。高海娜等［16］和苗明军等［17］成功利用SSR标记对甘蓝杂交种‘秦甘50’和‘西园4号’进行纯度鉴定。SSR分子标记鉴定与田间形态鉴定相比，准确性更高，速度更快，能大大提高检测效率，具有相当高的理论和应用价值。由于苦瓜基因组研究相对滞后，基因组序列资源非常有限，目前国内外关于利用SSR标记鉴定苦瓜杂交种纯度的研究报道甚少。本研究以苦瓜杂种一代热研二号及其父、母本为材料，建立了利用SSR分子标记技术进行苦瓜杂交种纯度鉴定的技术体系。通过对两种纯度鉴定结果比较分析发现，田间形态学鉴定与标记鉴定结果一致，热研二号种子纯度为98.82%。该结果说明本试验建立的SSR技术体系可用于苦瓜杂交种纯度的快速检测。

单对标记不易区分因隔离不严产生的生物混杂，因此利用单对标记鉴定杂交种纯度具有一定的局限性。为确保鉴定结果的准确性和可靠性，本研究选取4对共显性的SSR标记对热研二号的多个遗传位点进行检测，4对标记的检测结果一致，杂交种中仅混杂了母本自交种，该研究结果表明母本自交是降低热研二号油绿苦瓜杂交种纯度的主要原因。

4 结论

建立了快速、稳定的检测热研二号油绿苦瓜杂交种纯度的SSR分子标记技术体系，分子标记鉴定结果与田间形态学鉴定结果完全一致，为热研二号油绿苦瓜良种的安全使用提供了科学依据。

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（责任编辑 李楠）

Hybrid Purity Identification of Reyan No. 2 Using SSR Markers

Liu Ziji Zhan Yuanfeng Yang Yan
（Tropical Crops Genetic Resources Institute，Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences，Key Laboratory of Crop Gene Resources and Germplasm Enhancement in Southern China，Ministry of Agriculture，Danzhou 571737）

The purity identification of Reyan No.2 was performed by using SSR marker technique. The results showed that 5 SSR markers were polymorphic between the parents of Reyan No.2, among which 4 were co-dominant markers, one was dominant marker. To ensure the accuracy and reliability, 4 co-dominant SSR markers were used for purity identification of Reyan No.2. The hybrid purity was 98.82%, which was completely consistent with field identification. It is feasible to conduct purity identification of Reyan No.2 using SSR markers.

Bitter gourd SSR Reyan No.2 Purity identification

2013-09-06

海南省自然科学基金项目（312025），中央级公益性科研院所基本科研业务费专项资金资助项目（1630032012007，1630032012002）

刘子记，男，博士，助理研究员，研究方向：蔬菜分子生物学及遗传育种；E-mail：liuziji1982@gmail.com

杨衍，男，博士，副研究员，研究方向：瓜菜遗传育种；E-mail：catasvegetable@gmail.com