有害赤潮藻种塔玛亚历山大藻的研究进展

朱兴彪, 郑玉忠, 谢丽玲*, 张振霞, 查广才, 张 勇, 刘亚群

1.汕头大学理学院生物系, 广东 汕头 515063;

2.韩山师范学院生物系, 广东 潮州 521041

近年来，赤潮的发生日益频繁，爆发区域也不断扩大，已经成为全球性主要海洋灾害之一，因此，赤潮的相关研究也成为当前海洋环境研究的热门领域[1]。能引起海洋赤潮的藻类很多，来自甲藻门的藻种占大多数，其中，塔玛亚历山大藻(Alexandriumtamarense)就是甲藻门中最常见的赤潮藻种之一。塔玛亚历山大藻属于甲藻纲(Dinophyceae)、屋甲藻科(Goneodomataceae)、亚历山大属(Alexandrium)，是一种全球性的有毒赤潮藻；藻细胞的形状略近圆形，大小变化幅度较大，其长度20～52 mm，宽度17～44 mm，生长状态良好的情况下，细胞大小通常为28～33 mm。塔玛亚历山大藻的环沟和纵沟明显，横沟明显左旋，自横沟和纵沟相交处的鞭毛孔伸出两个鞭毛，一条带状横鞭环绕于横沟内做波状运动，使细胞旋转，另一条线状纵鞭从纵沟伸向体后做鞭状运动，使细胞前行，从而两者的结合使藻体做旋转运动[2]。

塔玛亚历山大藻的分布很广，在北极、温带及热带都有分布，在北半球温带的水域出现的频率最高，也是我国主要的赤潮发生物种之一。而且，塔玛亚历山大藻能产生麻痹性贝毒素(paralytic shellfish poisoning，PSP)，此毒素能在食用贝类体内累积，从而威胁人类的健康与生命安全，关于PSP毒素引起的中毒事件也屡见不鲜[3，4]。因此，相较于其他藻类，塔玛亚历山大藻引发赤潮的危害要大得多。基于塔玛亚历山大藻赤潮的普遍性和危害性，它成为当今赤潮生物研究的重要对象，国内外在其分布、形态学与分子鉴定、生理生态以及表达序列分析等方面开展了广泛的研究。本文通过对塔玛亚历山大藻的生长环境、分子鉴定、藻际竞争关系以及治理等方面研究进行概述，为在该藻种中开展更深入的研究提供一些有益的思路。

1 环境因子对塔玛亚历山大藻生长状况的影响

1.1N、P对塔玛亚历山大藻的影响

塔玛亚历山大藻广泛分布于我国沿海水域，近年来，它主导的有毒赤潮在我国沿海时有发生[4～7]。为了认识塔玛亚历山大藻的营养生理特点、繁殖规律和赤潮发生机制等，中国学者对其做了大量工作，并取得了许多成果。其中，营养盐(如氮和磷等)对塔玛亚历山大藻影响的研究较为透彻，主要集中在以下两个方面[8]：一方面是营养盐对塔玛亚历山大藻生长状态的影响机制[7～14]；另一方面是营养盐对塔玛亚历山大藻细胞产毒素含量或毒素成分的影响机制研究[4，14～19]。对不同地域的藻种进行营养盐的分析，可以让我们全面地了解这些藻种的生长特性[20]。

海水的富营养化主要是来自水中氮和磷的富集，它也是引起赤潮的物质基础和首要条件。氮、磷在海洋环境中的含量、形态构成和数量变动不仅影响着赤潮生物的生理、生化组成，还决定了赤潮形成的规模和程度。其中，氮是合成藻体内蛋白质、核酸和叶绿素等的基本元素[21]，磷是海洋、湖泊等水生生态系统初级生产力水平的关键因素，是海洋生物赖以生长的最基础营养物质之一，是藻类增殖必需的营养源[15]。研究发现，在氮限制的情况下，塔玛亚历山大藻亚种ATDH细胞经过G1和S期后会停滞于G2/M期，只有8％的细胞完成分裂，细胞数目只有少量增加[8]。低氮(非限制)的培养条件下，可以使藻快速进入对数生长期，后期适当的补充氮源，生长速率会随氮源浓度的增加而增加，但细胞有最适生长浓度，如果不足和超出此浓度，生长速率都不会达到最大甚至会抑制藻细胞的分裂[9，10]。这表明ATDH在对氮源的吸收过程中有一个反馈抑制调节机制，塔玛亚历山大藻通过这一机制来适应环境满足自身生长的需要；进一步的研究表明磷源对ATDH吸收氮源也产生重要的影响。在不同的磷浓度下，其对应的氮源的最适浓度和耐受性都不同，而且呈正相关。但是具体的作用机制还没有相关报道。从基因的表达和调控上进一步揭示这一作用机制，可以使我们更好地了解ATDH的生长特性。张玉娟等[11]发现氮(100 mg/L)、磷(15 mg/L)双因子限制下，细胞密度无明显增长。在单因子限制下，生长态势明显优于双因子限制。而且氮、磷单因子中度限制对生长影响较小，在磷受限的条件下，ATDH可以维持较长时间的稳定生长期，暗示了ATDH有很强的贮磷能力[21，22]，且其贮磷的能力远超过其他藻类。Sanudo-Wilhelmy等[23]的研究发现，浮游植物细胞表面可以吸附并内化无机磷，侧面支持了这一论断。然而ATDH对磷的吸收也是有限的，磷源过高也会对藻细胞的生长产生负面影响[12]。ATDH对氮源和磷源吸收以及两者之间的相互关系很可能帮助我们揭示赤潮爆发的内部机制。另一方面，氮源、磷源也会影响ATDH产生毒素，当氮源充足时，PSP的产量会增加；当氮源不足时，藻细胞首先合成自身必需的物质，PSP的合成将随之下降，以维持自身生长需要[19]。而当氮源充足时，磷的限制会促进毒素的合成[11，14，24]，说明ATDH通过大量的合成分泌PSP抑制其他藻类争夺磷源以满足自身需要。

1.2温度、pH、光照和盐度对塔玛亚历山大藻的影响

ATDH是一种光合自养型浮游生物，除了必需的物质基础外，其他环境因子，如温度、光照强度、pH和盐度对其生长繁殖都有重要的影响。温度对ATDH的影响非常大，其适宜生长温度在17～25℃[25]，且不同来源的藻种对环境温度要求不同。如大亚湾株最适温度19℃[22，24]。舟山株的是18～21℃[26]，香港株为21～25℃[10]，长江口海域的一株ATHD01最适温度为24℃，闽江口的一株ATMJ02最适温度为24℃，北部湾海域的一株ATGX02为20℃[27]。当温度低于10℃或高于30℃时，藻细胞会停止生长甚至会短时间死亡。深入研究发现当温度升高到30℃以上时，塔玛亚历山大藻的热休克蛋白Hsp70大量表达，起到应激保护作用以适应不利的环境[26]。pH对ATDH的生长繁殖也会产生非常大的影响。一般认为其最适的pH为7.5～8.0[25]，即接近海水的pH，但是也有例外，如大鹏湾株的最适pH为6.0～7.0[6]，在实验室培养藻的过程中发现pH会慢慢的上升，当达到稳定期时，pH甚至超过9.5，可能与营养盐的耗尽和分泌到培养液中毒素有密切关系；但细胞还能够维持活力，说明其对pH偏碱性环境的适应性非常强。塔玛亚历山大藻是一种喜高光强的微藻。实验室培养塔玛亚历山大藻的光照强度一般在4 000～5 000 lux。塔玛亚历山大藻(中国南海珠江口水域)的光饱和点是650 μmol/m2·s[25]，塔玛亚历山大藻(大亚湾株)的最适光照强度为1.6×1016/s·cm2[24]。塔玛亚历山大藻对盐度的适应范围非常宽。塔玛亚历山大藻(ATCI01)在盐度14～32.1 g/L范围内均可生长，在盐度范围23～27 g/L时生长最佳[6]。塔玛亚历山大藻(广东大亚湾)盐度在25～35 g/L时生长良好，最适盐度为30 g/L[24]。综上所述，来自不同海域的塔玛亚历山大藻种对温度、pH、光照和盐度的响应都存在不同程度的差异，但是差异性不强。这印证了在各种环境压力的长期选择下，塔玛亚历山大藻进化的多样性和保守性的统一，最终形成亚种，从而在不同的海域均有可能引发赤潮。

2 塔玛亚历山大藻复合种基于核酸分析的分子鉴定

塔玛亚历山大藻为一种世界性分布的赤潮藻，由于地域、气候和水质等一系列复杂的原因，产生许多亚种，统称为塔玛亚历山大藻复合种(A.tamarensespecies complex)[28]，并且可分为多个地理株系。如何快速、有效地鉴定区别这些亚种将有助于赤潮的预防和治理，甚至可以开发利用这些有害藻种。用传统的形态学方法鉴定，虽然直观简便，但是这些亚种在形态上非常相似，一般的显微镜很难区别，有人借助于扫描电子显微镜进行鉴别，但扫描电子显微镜的识别速度慢且昂贵，并不适合于大量样品的藻种鉴定，而且同一个亚种在不同的生长时期其形态也会有所不同[29]。目前，最适合的鉴别方式是利用分子生物学技术区分塔玛亚历山大藻的特征序列，如核糖体18S、28S rDNA及ITS等[30]。有人将SSU rDNA和ITS分子指标用于鉴别塔玛亚历山大藻和链状亚历山大藻(Alexandriumcatenella)，发现SSU rDNA和ITS相关序列可以准确判断塔玛复合种的地理基因型[31，32]。由于这些赤潮藻种的高变异速率，核糖体基因保守性高，显示的遗传多态性有限，难以区分具有共同地理来源的赤潮生物种群[33]，特别是各个亚种间的遗传多态性分析。因此，需要借助一种高分辨率、简便的方法对亚历山大藻种群遗传多样性进行快速鉴定。

短串联重复(short tandem repeats，STR)或简单序列重复(simple sequence repeat，SSR)指基因组中以少数几个核苷酸(多数为2～6个)为单位多次串联重复组成的长达几十个核苷酸的序列又称微卫星DNA (microsatellite DNA)，是一种共显性标记技术。在亲缘关系研究方面，由于等位基因高度多态，较少的简单序列重复(微卫星)位点即可提供个体特有的基因型组合，共显性则用于追溯子代中等位基因的亲本来源[34，35]。因此，在生物遗传多样性等研究中广泛应用。亚历山大藻属微卫星标记随即被很多学者作为一种分子标签使用，并且取得很多成果[35～38]。如，王东东等[38]从ATDH的ESTs中找到的SSR引物，用于遗传多样性的分析。发现中国海域分离的ATDH亚种在进化距离上非常相近。符合传统分类学的标准。同样来自中国海域的A.catenellaACDH01在聚类图上与A.tamarense的距离较近，但并非同一进化枝，而是拥有自己独立的分支[38～40]。有研究者通过SSR引物对9株来自欧洲和中国等不同海域的塔玛亚历山大藻进行了遗传多样性分析，可以将其分为3个进化枝，且进化枝与藻种的地理位置相关联[28]。SSR分子标记的重复性稍差，易造成假阳性，但其优点也不言而喻，数量丰富，可以覆盖整个基因组，揭示的多态性高，具有多等位基因的特性，信息量丰富，因此特别适合ATDH的种内遗传多态性分析[41]。

3 塔玛亚历山大藻的藻际竞争关系

为解释赤潮发生过程中种群演替的内在规律，在实验室内研究不同藻种间竞争机制是非常必要的。一些研究者对塔玛亚历山大藻与其他藻之间的竞争关系进行了初步探索。首先，发现起始浓度对藻际竞争的结果具有明显影响。董云伟等[42]把塔玛亚历山大藻和赤潮异弯藻(HeterosigmaakashiwoHada)按不同接种比例进行混合培养，发现A.tamarense∶H.akashiwo(A∶H)=1∶4时，H.akashiwo在竞争中占优势；而当A∶H=1∶1或A∶H=4∶1时，A.tamarense在竞争中占优势。由希华等[43，44]对东海原甲藻(Prorocentrumdonghaiense)与塔玛亚历山大藻种间竞争的研究中发现，当接种细胞密度比为2 000∶100或2 000∶200时，东海原甲藻占优势，但是当接种细胞密度比为4 000∶400时，塔玛亚历山大藻占优势，因此起始接种浓度比例并不起决定作用，接种的数量规模也会左右藻种间的竞争结果。高、低磷酸盐浓度也会影响两物种种群增长与种间竞争关系，营养盐限制环境中，东海原甲藻为竞争优势种；丰富营养盐环境中，种间竞争具有明显的密度依赖性。高亚辉等[45]在研究沃氏藻(Woloszynskiasp.)与塔玛亚历山大藻种间竞争的关系中也得到了相似的结论。张培玉等[46]研究了塔玛亚历山大藻(A)和中肋骨条藻(S)种群竞争关系，当接种比例为A∶S=1∶1时，虽然塔玛亚历山大藻在竞争中占优势，但也受到中肋骨条藻的抑制；接种比例为A∶S=4∶1时，塔玛亚历山大藻的生长竞争优势更加明显，但是在紫外线的照射下，塔玛亚历山大藻的竞争优势明显衰退。因此，影响藻种竞争优势的因素除了藻种自身密度、数量外，还有外部的条件，如营养盐浓度、太阳紫外线照射等，都可能限制该地区赤潮爆发的种类、规模以及持续的时长。影响赤潮藻种竞争能力的另一个重要方面就是赤潮藻种通过分泌某些化学物质，即所谓的化感作用，来抑制其他藻种的生长[47～49]。塔玛亚历山大藻不仅可产生对人体和其他海洋动物有害的PSP毒素[50]，还能合成多种次生代谢物，如溶血毒素等。这些毒素可能在塔玛亚历山大藻与其他藻的竞争中扮演着重要的角色。有研究发现塔玛亚历山大藻的细胞滤液对东海原甲藻的生长确实有显著的抑制作用[51]，而这些细胞滤液就含有溶血毒素。但是，目前国内外对塔玛亚历山大藻化感作用研究多处于起始阶段，仅仅涉及化感现象的观察、化感物质的提取和分离鉴定等方面，对化感物质的作用机制研究较少[52]。因此，为了更为全面的了解赤潮藻种演替机理，需要对藻种的化感物质对其他藻种的抑制作用进行更为全面的分子生物学研究，以及相关的生态学、水文学和气象学等的研究。

4 塔玛亚历山大藻的治理

近年来，我国沿海海域赤潮爆发的规模和次数都呈上升趋势，严重制约着我国沿海经济特别是渔业、旅游业的可持续发展。如何有效控制富营养化水体中的藻类爆发，成为环境领域的研究热点[53]。赤潮藻种的治理方案按抑藻剂性质划分，可以分为物理抑藻剂、化学抑藻剂和生物化学抑藻剂[54～55]。在物理抑藻剂中，有人发现UV-B照射可使亚历山大藻可溶性蛋白含量和叶绿素a含量呈现降低的趋势，H2O2、丙二醛含量和超氧化物歧化酶活力呈现升高的趋势，暗示UV-B照射导致亚历山大藻体内产生过量的活性氧自由基，由于这些物质无法及时消除而对藻产生了损害[56]。但是，该方法缺陷也很明显，无法在实际中操作。还有人用特殊性质的粘土来抑制赤潮藻，通过在藻类赤潮爆发区撒粘土，利用其强大的吸附作用而把藻转移到海底使其死亡[57]。但是该法工作量太大，且不能标本兼治，大多数藻会产生休眠体孢子，等时机成熟休眠孢子会复苏，仍有爆发赤潮的可能，其规模化使用仍需进一步评估。在化学抑藻剂中，表面活性剂为常见类型，其具有特殊的双亲媒性基团，容易吸附在具有膜层结构的藻细胞表面，从而影响和破坏藻细胞的正常生理功能，如影响细胞对一些营养盐的吸附吸收作用。龚良玉等[58]用烷基糖苷季铵盐抑制塔玛亚历山大藻的生长，发现其在较低的浓度范围内(< 0.5 mg/L)就可对藻种产生抑制作用。其他化学试剂，如对羟基苯甲酸，可使塔玛亚历山大藻受到胁迫并产生细胞固缩，从而可能引起细胞凋亡，并且对藻种的硝酸还原酶(nitratereductase，NR)有明显影响，而NR又是氮代谢关键性酶，它将浮游植物所吸收的氧化态氮化合物转化为还原态的氮，进一步合成氨基酸和蛋白质[59，60]。但是化学抑藻剂易给环境带来二次污染，使用剂量通常也不低[61]，从经济和使用效果角度讲，都无法满足实际需要。因此，利用生物化学抑藻剂来抑制有害藻类生长的研究受到广大学者的极大关注[24]。

有人研究抗生素对塔玛亚历山大藻的抑藻特性和机理[62，63]，但是抗生素的使用也同样存在经济效益和环境二次污染的问题。因此，有些学者把研究的方向转移到了一些常见植物对藻的抑制作用的研究。如研究发现，玉米秸秆对塔玛亚历山大藻的生长的抑制作用非常显著，玉米叶的抑藻作用强于玉米茎秆，推测主要是由于玉米秸秆中含有的十八碳二烯酸、十八碳三烯酸和棕榈酸等长链脂肪酸类物质是抑藻的主要化学成分，可能对藻细胞在营养盐的吸收方面产生负作用[64，65]。刘玉荣等[66]用桉木粉及其丙酮粗提物对塔玛亚历山大藻生长的影响进行探索，1 g/L托里桉木粉48 h对塔玛亚历山大藻抑制率为56.0％，托里桉木粉水-丙酮提取物(相当1 g/L托里桉木粉)对藻的抑制率与前者相当，认为托里桉木粉中存在的化学物质可能抑制藻类生长。而且使用量上也相对少，短期见效，但缺乏现场实验。张孝杰等[55]用相同抑藻剂(绿茶浸提液及绿茶粉)与不同载体组配后对塔玛亚历山大藻抑制效果进行探索，发现海藻酸钠固定化绿茶浸提液及绿茶粉对赤潮藻塔玛亚历山大藻均有较高的抑制率，前者比后者的抑藻作用快5～24 h；单纯的海藻酸钠小球对藻种也有较好的抑制效果；PVA高分子棉片固定绿茶浸提液对藻种的抑制率与海藻酸钠固定化绿茶浸提液接近，但是用绿茶抑藻显然不经济，不实用。孙颖颖等[67]研究了浒苔不同溶剂的提取物对塔玛亚历山大藻的抑制作用，发现利用甲醇浸泡浒苔可以获得具有明显抑藻活性的粗提物。Pillinger等[68]研究表明，杉木的各个器官的水浸液均含有多种酚类化合物，都可以抑制塔玛亚历山大藻的生长。还有如大蒜粗提液、黄连和槟榔浸提液、凤眼莲根提取物、孔石莼水溶性抽提液以及鲜龙须菜的抽提液和干粉末对塔玛亚历山大藻也有抑制作用[69～72]。用植物直接去抑制赤潮藻华是否也会带来二次污染，亦值得进一步的探索。而且海水的稀释作用会在短时间内把有效的抑藻成份稀释，抑制效果也会大打折扣。但是陆地植物种类繁多，如何去寻找使用简单、价格低廉、少量高效、短时高效且对其他鱼贝虾类等无害甚至有益的植物去抑制赤潮毒藻的蔓延，是一个实验量大但是又非常有意义的工作。

除了对植物抑藻作用的研究外，一种“以菌抑藻”的新型安全控制藻的方法受到广大研究者的关注。傅丽君等[73]从福建漳江口红树林区沉积物中分离出一株可以抑制塔玛亚历山大藻生长的菌株，属于微泡菌属(Microbulbifersp.)，它的抑藻机理可能是通过抑制藻细胞光合作用，降低抗氧化酶活性同时加大膜脂过氧化起到对塔玛亚历山大藻的溶解作用，并呈现出类程序性死亡特征。尹艳等[74]从大连黑石礁海域分离的溶藻细菌JM-1与塔玛亚历山大藻共培养，发现JM-1能强烈抑制塔玛亚历山大藻的生长，且具有一定的溶藻特异性。曹宾霞等[75]从辽宁大连周边海域分离的37株海洋细菌中，发现5株溶藻菌株具有良好的溶藻能力。郑天凌等[76，77]在厦门西海域获得了3株能有效抑制甚至杀死塔玛亚历山大藻的菌株，其中的S5、S10两株对塔玛亚历山大藻的作用是比较显著和有规律性的。此外，在中国东海分离出了一株假交替单胞菌属(Pseudoalteromonassp.)的细菌，可以分泌一种物质，对塔玛亚历山大藻具有非常好的溶藻作用[78]。李玉瑛等[79]发现用铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)产生的鼠李糖脂对塔玛亚历山大藻生长和运动形成良好抑制作用，15 mg/L的鼠李糖脂能使藻细胞遭到不可逆的破坏。

生物化学方法治理赤潮因具有高效、选择性高以及对环境友好等特点而受到人们的重视。一方面，赤潮的爆发是多种因素综合作用的结果，所以仅靠一种治理方案往往难以取得理想效果。各种方法间需要相互补充，综合使用[80]，如把一些植物的杀藻特性和粘土的吸附特性相结合去治理一些沿海渔场的赤潮问题。另一方面，实验室的研究与复杂的海洋生态系统实地修复具有较大的差距，目前只有浒苔、江蓠、龙须菜和孔石莼等少数大型海藻原位抑制赤潮的案例[81]。需要投入更多的人力、物力以及财力资源对一些实验室抑藻效果非常好的方法开展赤潮区实际应用试验。

5 问题与展望

作为赤潮毒藻的关键藻种之一，塔玛亚历山大藻的研究越来越受到关注。本文对近年来有关塔玛亚历山大藻的生理生长特性、遗传多样性、藻际关系、化感作用及治理方面所做的工作进行了系统的总结。但是，一些关键的问题还悬而未决。首先，塔玛亚历山大藻对其他藻种的化感作用，只是通过一般的试验方法证明了化感作用的存在，并提出了一些假说，如何从分子生物学的角度去解释说明这些假说的真实性，还有待进一步的研究。其次，赤潮的发生是一个复杂的过程，除了在已知的营养盐和环境因子对赤潮的爆发起着关键的作用外，其他的一些因素可不容忽视，如海洋流、幅聚作用和海洋特有的生态环境等，而这些因素在实验室是无法人工模拟的。因此，为了更全面的了解赤潮爆发的原因，除了在实验室对藻的生长进行初步探索外，更需要对赤潮关键藻塔玛亚历山大藻进行野外的原位培养，特别是在赤潮爆发的季节进行原位培养，通过记录更全面的影响因子的变化和赤潮藻的种类和数目，经数据处理来寻找它们之间的相关性，可以更深入全面地了解影响赤潮爆发的相关因素，为今后赤潮的预测提供更为科学可靠的依据。除了从宏观因子来解释赤潮爆发的机理外，另一个重要的问题是，如何从细胞内部的微观变化来阐明赤潮爆发的分子机理，即如何利用宏转录组学和宏蛋白质组学技术，来研究赤潮藻种对环境变化做出的反应。有人利用宏转录组学来揭示米氏凯伦藻(Kareniamikimotoi)对简单环境变化响应的分子机制。发现在氮元素限制下，氨和硝酸盐转运基因和谷氨酰胺合成酶基因高表达，在磷元素限制下则没有发现明显差异表达的基因[82]。因此，也有必要对塔玛亚历山大藻在不同的营养环境中相关基因的转录水平和翻译水平进行定性和定量分析。从宏观和微观两方面入手探索赤潮的形成过程，将有助于对赤潮的预防和治理做到有的放矢，将其引起的损失降到最低。

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