遮荫对水稻冠层叶片SPAD值及光合、 形态特性参数的影响

杨 虎, 戈长水， 应 武， 杨京平*， 李金文， 何俊俊

(1 浙江大学环境与资源学院， 浙江杭州 310058； 2 杭州市农业科学研究院， 浙江杭州 310024)

光照是影响作物生长和产量的重要因素之一。Kobata[1]发现水稻在轻度遮荫下生长状态受影响不大，然而在重度遮荫下产量会下降。长江中下游地区是中国水稻的主要产区之一，该地区阴雨天气对水稻的生长发育会造成一定的影响，导致水稻产量的下降。实践证明，水稻开花期和灌浆期光照充足，结实率和千粒重提高，产量增加; 反之，多阴雨寡光照，结实率和千粒重下降，产量降低[2]。可见光照对提高水稻产量、 发挥品种生产潜力具有重要作用。因此，探讨水稻对不同光照条件的适应性机理，对充分发挥其高产特性、 提高其高产生态稳定性具有重要的科学意义。本文研究了未遮荫及遮荫后光照对水稻叶片光合形态生理特性的影响，探讨了水稻对环境光照的适应机理。通过对未遮荫和遮荫条件下，冠层叶片SPAD值、 光合形态指标、 快速叶绿素荧光诱导动力学曲线的分析，深入了解光照因素对水稻冠层叶片叶绿素荧光参数光系统II(PSⅡ)的影响以及光合特征参数对环境的适应机制，为不同光照条件下，研究利用SPAD值与叶绿素荧光参数之间的关系，实时监测水稻生长与光照效应奠定良好的基础，进一步为水稻的高效栽培和增产提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验设计

实验在浙江大学华家池校区温室进行，水稻品种为甬优9号(YY9杂交稻)和丙9363(B9363粳稻)。人工气候室内育秧，2009年2月10日将带有5片叶的秧苗移栽塑料桶中，桶内装土，土表面积为0.051 m2，每个塑料桶3丛，每丛2株幼苗，每个品种10桶，共计20桶。施氮量为225 kg/hm2(常规施肥量)，3次施肥(分蘖肥20%、 孕穗肥50%、 抽穗肥30%)，过磷酸钙(225 kg/hm2)和氯化钾(75 kg/hm2)在移栽的时候施入，另外75 kg/hm2的氯化钾在移栽后40天施入。2月20日用遮阳网分别将每个品种的水稻5桶遮荫，遮荫时间为45天。未遮荫和遮荫处理环境的光合光量子通量密度(PPFD)和温度见图1。盆栽土壤取自杭州市农科院实验农场，土壤质地为壤土，有机质和总氮含量分别为35.50 g/kg和2.05 g/kg。

图1 未遮荫和遮荫条件下光合光量子通量密度(PPFD)和温度的动态变化Fig.1 The dynamics of PPFD and temperature under unshaded or shaded condition

1.2 测定和分析

1.2.2 叶片厚度和SPAD值的测量 叶片厚度利用中国计量学院计量与测试学院开发的YI-20010A型叶片厚度测量仪测量。利用数显千分尺，间接标定法进行，千分尺推动植物叶片厚度仪的传感器测头运动，记录千分尺移动距离与被标定仪器YI-20010A与叶片参数仪之间的位移变化关系曲线，并对正、 返程进行了测试。由于温度的变化会引起叶片厚度的变化[3]，因此，在叶片厚度的测量过程中保持环境温度一致。利用SPAD-502计从2月23日起连续测量顶部完全展开叶的SPAD值，间隔时间大约为10天(根据天气)，每个处理共测量15片叶。

1.2.3 叶片叶绿素含量的测量 待测叶片放入装有水的塑料瓶中，一起放入4℃冰箱中。测定之前，先将叶鞘剪掉，称重后把叶片剪碎放入25 mL比色管中，加入少许的碳酸钙，并加适量的96%酒精浸提。将比色管放入恒温振荡箱中，在40℃下放置过夜后，待叶片完全变白后，将剩余的叶片过滤掉，并用酒精对叶片残渣进行洗脱，然后再用96%的酒精标定到25 mL，最后在665nm和649nm处测定吸光度 (LAMBDA 45, 140 PerkinElmer, USA)。叶绿素a和b的计算公式为[4]：

Chlorophyll a=13.95A665-6.88A649

(1)

Chlorophyll b=24.96A649-7.32A665

(2)

Total chlorophyll=6.63A665+18.08A649

(3)

根据叶片鲜重和叶片的面积，计算水稻叶片单位面积(chlorophyll content based on per unit area)与单位鲜重(chlorophyll content based on per unit fresh weight)的叶绿素含量。

1.2.4 叶片光合特征数据测量 3月23日利用Li-6400便携式光合测定系统(Li-Cor, Lincoln, NE, USA)测定叶片的净光合速率(Net photosynthetic rate, Pn), 使用开放气路, 测定前, 叶片在光合作用饱和光强下诱导大约30 min。测定时使用大气CO2浓度, 用6400-02B LED红蓝光源控制光强, 依次设定PPFD为1200、 1000、 800、 600、 400、 200、 100、 50、 25、 0 μmol/(m2·s), 每一光强下停留200 s。

1.2.5 叶绿素荧光参数的测量 利用配置大探头IMAG-MAX/L的调制荧光成像系统MAX- IMAGING-PAM(WALZ,德国)测量全叶片叶绿素荧光动力学。主要叶绿素荧光参数如下[5]：

Fo， 固定荧光或初始荧光产量；

Fv， 可变荧光产量；

Fm， 最大荧光产量，Fm=Fo+Fv；

ΦPS II， 实际光化学效率，ΦPSII=(Fm′-F)/Fm′。

相对电子传递速率(electron transport rate, ETR)：ETR=ΦPSII·PPFD·0.5×0.84，其中0.5是假设吸收的光被两个光系统均分得到的参数,0.84是吸光系数。

ETR随PPFD的变化图像为光响应曲线，即使光化光的持续时间短至10 s，也可得出典型的光响应曲线，这被称为快速光曲线(rapid light curve, RLC)。为了测定不同光照梯度下叶片的RLC，设置光照梯度为0、 20、 55、 110、 185、 280、 395、 460、 541、 602、 700、 800和925μmol/(m2·s)，间隔时间为10 s。为对RLC进行量化描述，根据Plaat[6]等的方程进行曲线拟合：

P=Pm·(1-ea·PPFD/Pm)·e-β·PPFD/Pm

(4)

其中，P是相对电子传递速率； Pm是潜在的最大光合速率； a为初始斜率，反映了光能的利用效率； β为光抑制参数，高光强下下降部分的斜率。

1.2.6 数据分析 未遮荫或遮荫处理下叶片生理形态数据利用SPSS16.0 (SPSS for windows, Version 16.0, USA) 单因素方差分析进行0.05水平的Duncan’s-test统计分析，曲线拟合采用SPSS的Nonlinear模块和Origin8.0进行分析。

2 结果与分析

2.1 遮荫对水稻冠层叶片SPAD值、 叶绿素含量和生理形态特征的影响

图2 未遮荫和遮荫条件下甬优9号(A)和丙9363(B)叶片SPAD值的动态变化Fig.2 The dynamics of SPAD readings of YY 9 (A) and B 9363(B) under unshaded and shaded condition

表1 不同光照处理甬优9号和丙9363的比叶重(g/m2)、 叶片厚度(μm)、 叶绿素含量和叶绿素a/b

2.2 遮荫对水稻冠层叶片光合特征的影响

遮荫使得两个品种的最大净光合均显著下降(表2)，遮荫条件下，丙9363的气孔导度无显著变化，表明丙9363气孔导度对遮荫有一定的补偿作用,但是甬优9号的气孔导度却显著下降。同样，遮荫对丙9363胞间CO2和蒸腾速率无显著影响，但却显著降低了甬优9号胞间CO2浓度和蒸腾速度，可能是气孔导度与胞间CO2浓度和蒸腾速率密切相关，蒸腾速率的下降会导致胞间CO2浓度和气孔导度的下降，从而导致了最大净光合的下降。

表2 未遮荫和遮荫条件下甬优9号和丙9363叶片光合交换特征

图3表明，随着PPFD的增加，两个水稻品种的叶片光响应曲线逐渐增大，遮荫显著降低了最大净光合速率(Pmax)，量子效率，光补偿点和光饱和点，表明遮荫导致水稻的光合能力下降(表3)。叶片的呼吸速率下降是为了适应弱光照环境，大幅度减少了自身的呼吸消耗，以增加对有限光能的利用。遮荫时，Pn的降低是光照强度、 叶绿素含量、 气孔和光系统光能分配自我调节共同作用的结果。遮荫后叶片光补偿点和光饱和点降低，表明遮荫导致叶片光合系统的暗反应效率下降，对光能的需求降低[10]。

图3 未遮荫和遮荫甬优9号(A)与丙9363(B)的光响应曲线Fig.3 Light response curve of YY9 and B 9363 under shading or unshading conditions

表3 未遮荫和遮荫条件下甬优9号和丙9363的光响应曲线拟合结果

图4 甬优9号(A)和丙9363(B)的快速光曲线Fig.4 Rapid light curves of YY 9 (A) and B 9363 (B)

2.3 遮荫对水稻冠层叶片叶绿素荧光参数的影响

2.3.1 未遮阴与遮阴条件下水稻冠层叶片的快速光曲线 由图4可知，遮荫对快速光曲线的初始斜率的影响不大，说明遮荫对水稻捕光系统无明显影响。由表4可知，未遮荫与遮荫条件下，光抑制系数均非常小，说明光抑制发生不明显。然而遮荫条件下，潜在最大电子传递速率显著下降，说明遮荫使电子传递能力减弱，这可能是叶片光合能力下降的原因。ΦPSII不仅与碳同化有关,也与光呼吸及依赖O2的电子流有关，代表线性电子传递的量子效率[11]。

表4 图4拟合的结果

2.3.2 未遮荫和遮荫条件下水稻冠层叶片PS II的最大量子产量(Fv/Fm) 遮荫条件下，两个水稻品种F0均较高(图5A)， 这同牟会荣等[12](2008)研究的结果类似。遮荫降低了两个水稻品种的Fm和Fv/Fm(图5B,C)，Fv/Fm值下降表明遮荫降低了叶片最大光化学效率。光照过弱会使PSII原初光能转化效率下降，抑制了水稻光合作用的原初反应，进而影响光合作用整个过程。遮荫降低了Fm(图5C)，说明遮荫对PSII的电子传递产生影响，Fm是暗适应的光合机构全部PSⅡ反应中心处于完全关闭时的荧光产量，Fm反映PSⅡ的电子传递情况[13]。

2.3.3 不同光照水平下水稻冠层叶片SPAD值与PS IIFv/Fm之间的关系 通过对不同光照水平下，两个水稻品种冠层叶片SPAD值与PS II的Fv/Fm之间关系的拟合发现，随着SPAD值的增大，PS II的Fv/Fm呈现出先增大后趋向于稳定的现象，形成了指数式模型关系式(图6)。光合作用过程中，Fv/Fm与O2转化的量子产量成正相关关系，其最大值在0.85左右说明PS II正处于高效的激发能状态，此时叶片处于未遮荫状态，叶片SPAD值相对较高。根据两个品种的SPAD值与Fv/Fm拟合的回归模型计算结果可知，SPAD值大约为35时，Fv/Fm开始出现明显下降的趋势，所以，当SPAD 值小于35时，叶片PS II可能处于受损状态中。Kumagai等[14]研究水稻叶片SPAD值与Fv/Fm之间的回归模型发现当SPAD值在30左右，PS II可能处于受损的状态，这可能是由于不同水稻品种和生长环境产生的差异。由图6可知，未遮荫条件下，水稻冠层叶片的SPAD值可以作为PS II的Fv/Fm的指示。

图5 未遮荫和遮荫情况下甬优9号和丙9363的F0(A)、 Fv/Fm(B)和Fm(C) Fig.5 F0 (A), Fv/Fm (B) and Fm(C) of YY9 and B9363 under different shading treatments

图6 未遮荫和遮荫条件下水稻冠层叶片SPAD值与PSII的Fv/Fm之间的关系(A: YY9; B: B9363) Fig.6 Correlation between the SPAD readings and Fv/Fm of PSII in canopy leaves of rice plants in different lighting conditions (A: YY9; B: B9363)

3 讨论和结论

对于光照的响应，不同品种的水稻叶片SPAD值不同。有的品种对于光照的时间具有一定的耐受性，同时要考虑种植密度对叶片SPAD值的影响。总之，不管什么水稻品种，遮荫都会显著降低其冠层叶片SPAD值，延缓其生长，只是个别品种耐荫强，其冠层叶片SPAD值变化较小。叶片SPAD值与叶绿素含量成正比，而叶片叶绿素含量又与氮含量密切相关，通常SPAD值被用来衡量叶片氮含量的高低[14-15]。遮荫条件下，水稻叶片变薄，叶绿素a/b和最大净光合速率下降，导致CO2同化速率和氮的吸收率降低[16-17]，进一步解释了SPAD值变小的原因。由此可见，SPAD值可以反映由光照时间的不同引起的叶片氮素含量的高低。叶绿素a/b值同叶片所接受的光照密切相关，遮荫条件下，叶片叶绿素a/b降低(表1)。可见，叶绿素a/b可以反映冠层叶片的光照情况。大豆叶片中，叶绿素a/b值在品种间存在一些差异[18]，然而不同水稻品种间，叶绿素a/b是否存在显著差异，还需要大量的田间试验给予证实。叶绿素荧光动力学方法可以快速、 灵敏、 无损伤地探测光照对植物光合生理的影响，光照条件与植物荧光参数Fv/Fm、 Fv/Fo、 ΦPSII等的受抑制程度密切相关。本试验结果表明，遮荫降低了甬优9号和丙9363叶片的ΦPSII，这可能是促使ETR降低的原因，也可能是改变光合特征的重要原因之一。遮荫对水稻叶绿素荧光参数ETR有不同程度的降低(图4)，说明遮荫条件下，水稻叶片吸收的光能往往达不到其固定CO2所需的能量，从而降低其所产生激发能。这些激发能满足不了自身体内细胞活动的基本需求，无法产生足够的活性氧，从而降低了PSII的反应中心和原初光化学反应。结果进一步证实，叶绿素荧光技术可以简便、 快速地测定出植株光合作用的变化，从而寻找到植物生长发育最适宜的营养环境。

Fv/Fm是光化学效率的指标，非环境胁迫下其极少变化，而且不受物种和自身条件的影响，通常在0.8左右，遭受光抑制后，叶片的Fv/Fm明显下降。本试验表明水稻叶片SPAD值与Fv/Fm表现出指数式回归关系，这同Kumagai等[14]对水稻的研究结果类似，Netto等[19]在对咖啡树的研究中发现，当SPAD值小于40的时候，Fv/Fm值显著下降，这也表明水稻叶片SAPD值可以间接地用于水稻冠层叶片光合能力的指示。这是因为叶片Fv/Fm与二磷酸核酮糖羧化酶含量表现出指数式回归关系，而二磷酸核酮糖羧化酶与叶片同化CO2的能力正相关，而叶片同化CO2的能力又与PSII中的光合电子传递功能密切相关[14,17]。然而，本文只研究了未遮荫和遮荫下水稻冠层叶片SPAD值与叶绿素荧光参数(Fv/Fm)之间粗略的关系，以及叶片叶绿素荧光参数和生理生态特征的变化情况，至于在不同强度和时长的光照条件下，水稻冠层叶片叶绿素荧光参数和其他生理生态特征会发生怎样的变化，是否能通过SPAD计对叶绿素荧光参数进行精准的预测，还需要进一步的研究探讨。

参考文献:

[1] Kobata T, Sugawara M, Sadanori T. Shading during the early grain filling period does not affect potential grain dry matter increase in rice [J]. Agronomy Journal, 2000, 92: 411-417.

[2] 李林, 姚永康, 刘敏华, 等. 水稻开花灌浆期阴天影响产量构成的光质环境分析[J]. 江苏农业学报, 1997, 13: 139-142.

Li L, Yao Y K, Liu M Hetal. Analysis of the environment of light quality for the effects of cloudy days on rice yield formation during flowering-filling period [J]. Jiangsu Journal of Agriculture Science, 1997, 13: 139-142.

[3] Schroeder C A. Diurnal changes in leaf thickness of Avocado [M]. Yearbook: California Avocado Society, 1980. 143-145.

[4] Arnon D I, Whatley F R. Factors influencing oxygen production by illuminated chloroplast fragments[J]. Archives of Biochemistry, 1949, 23: 141-156.

[5] 张守仁. 叶绿素荧光动力学参数的意义及讨论[J].植物学通报, 1999, 16: 444-448.

Zhang S R. A discussion on chlorophyll fluorescence kinetics parameters and their significance [J]. Chinese Bulletin of Botany, 1999, 16: 444-448.

[6] Platt T, Gallegos C L, Harrison W G. Photo inhibition of photosynthesis in natural assemblages of marine phytoplankton [J]. Journal Marine Research, 1980, 38: 687-701.

[7] Bond B J, Farnsworth B T, Coulombe R A, Winner W E. Foliage physiology and biochemistry in response to light gradients in conifers with varying shade tolerance [J]. Oecologia, 1999, 120: 183-192.

[8] Pandey S, Kushwaha R. Leaf anatomy and photosynthetic acclimation inValerianaJatamansiL. grown under high and low irradiance [J]. Photosynthetica, 2005, 43: 85-90.

[9] Fitter A H, Hay R K M. Environmental physiology of plants [M]. Academic Press, London, 1981, 35-38.

[10] 张坤, 万永善, 刘风珍, 等. 花生幼苗的光合特性对弱光的响应[J]. 应用生态学报, 2009, 20: 2989-2995.

Zhang K, Wan Y S, Liu F Zetal. Response of photosynthetic characteristics of peanut seedlings leaves to low light [J]. Chinese Journal of Applied Ecology, 2009, 20: 2989-2995.

[11] 陈建明, 俞晓平, 程家安. 叶绿素荧光动力学及其在植物抗逆生理研究中的应用[J]. 浙江农业学报, 2006, 18: 51-55.

Chen J M, Yu X P, Cheng J A. The application of chlorophyll fluorescence kinetics in the study of physiological responses of plants to environmental stresses [J]. Acta Agriculture Zhejiangensis, 2006, 18: 51-55.

[12] 牟会荣, 姜东, 戴延波, 等. 遮荫对小麦旗叶光合及叶绿素荧光特性的影响[J]. 中国农业科学, 2008, 41: 599-606.

Mou H R, Jiang D, Dai Y Betal. Effect of shading on photosynthesis and chlorophyll fluorescence characters in wheat flag leaves [J]. Scientia Agricultura Sinica, 2008, 41: 599-606.

[13] Lichtenthaler H K, Rinderle U. The role of chlorophyll fluorescence in the detection of stress conditions in plants [J]. Critical Reviews in Analytical Chemistry, 1988, 19: S29-S85.

[14] Kumagai E, Araki T, Kubota F. Correlation of chlorophyll meter readings with gas exchange and chlorophyll fluorescence in flag leaves of rice (OryzasativaL.) plant [J]. Plant Production Science, 2009, 12: 50-53.

[15] Lin F F, Qiu L F, Deng J Setal. Investigation of SPAD meter-based indices for estimating rice nitrogen status [J]. Computers and Electronics in Agriculture, 2010, 71S: S60-S65.

[16] 李金文. 基于水稻叶片生理生态学特征的氮营养诊断[D]. 浙江杭州: 浙江大学博士学位论文, 2005.

Li J W. The diagnosis of rice N status based on leaf physioecological characteristics [D]. Zhejiang Hangzhou: PhD dissertation of Zhejiang University, 2005.

[17] Warren C R, Adams M R. Distribution of N, rubisco, and photosynthesis in Pinuspinaster and acclimation to light [J]. Plant, Cell and Environment, 2001, 24: 597-609.

[18] Fritschi F B, Ray J D. Soybean leaf nitrogen, chlorophyll content, and chlorophyll a/b ratios [J]. Photosynthetica, 2007, 45: 92-98.

[19] Netto A T, Campostrini E, Oliveira J Getal. Photosynthetic pigments, nitrogen, chlorophyll a fluorescence and SPAD-502 readings in coffee leaves [J]. Scientia Horticulture, 2005, 104: 199-209.