食品中氯霉素残留快速检测技术研究进展

张威，赵晓娟，陈海光

（仲恺农业工程学院轻工食品学院，广东广州510225）

食品中氯霉素残留快速检测技术研究进展

张威，赵晓娟*，陈海光

（仲恺农业工程学院轻工食品学院，广东广州510225）

氯霉素类抗生素残留引起的食品安全问题已引起人们的普遍关注。简述动物源性食品中氯霉素类抗生素残留状况，综述2004年以来氯霉素类抗生素残留常用检测技术的开发应用情况，重点介绍免疫速测、传感器等快速检测技术的最新研究进展及应用，最后对氯霉素类抗生素残留检测技术的发展趋势进行讨论。

食品安全；氯霉素；残留；快速检测

氯霉素类抗生素（Chloramphenicols，CAPs），是一类包括氯霉素（Chloramphenicol，CAP）以及一系列氯霉素衍生物的广谱高效抗菌性药物。1947年，Ehrlich等[1]首次从委内瑞拉链霉菌（Streptomyces venezuela）中分离得到CAP。1948年，CAP的结构被确定并成为第一种完全由人工合成的抗生素[2]。目前，我国常见的药用氯霉素类抗生素有氯霉素、甲砜霉素（Thiamphenicol）和氟甲砜霉素（Florfenicol）等。该类抗生素主要通过转换抗生素自身和改变微生物代谢机制[3]对多种病原菌起到较强抑制作用，因而广泛用于动物各种细菌性传染疾病的治疗，对各类家禽、家畜、水产品及蜂蜜制品各种传染性疾病的控制和治疗起重要作用[4]。

医学研究表明，肉、蛋和奶等动物源性食品中的CAPs残留对人体有严重的副作用，长期微量摄入会使一些致病菌产生耐药性，并且引起机体正常菌群失调，使人们容易感染各种疾病。此外，CAPs对人的骨髓细胞、肝细胞具有毒性作用，尤其是会引起与计量和疗程无关的不可逆再生障碍性贫血[5]。因此，许多国家已出台了关于氯霉素类药物禁用的相关法律法规和政策。例如，欧美仅允许氯霉素用于非食用动物；我国农业部2002年发布《食品动物禁用的兽药及其他化合物清单》，规定禁止在所有动物源性食品中使用氯霉素。但由于CAPs价格低廉、抑菌效果好，目前仍被少数厂家违规使用，既对人类的健康造成极大威胁，也大大挫伤了人们对食品安全的信心。食品安全事件的频发和保障食品安全涉及到很多层面，但是无疑分析检测技术是保障食品安全的重要技术支撑，从监督层面对保证食品质量安全、保障人民身体健康等方面起到积极的促进作用。氯霉素类抗生素残留的检测技术主要有微生物检测技术、色谱检测技术、光谱分析技术和免疫速测法等快速检测技术。

1 微生物检测技术

微生物法的测定方式可分为两种：一种是基于抗生素对微生物生长的抑制作用[6]；另一种是由于发光微生物对氯霉素敏感而引起生化特性的变化，如氯霉素对鳆发光杆菌具有抑光作用，通过检测鳆发光杆菌发光强度的变化可以检测氯霉素的含量[7-8]。微生物法经济简便、容易操作，可用于多种抗生素类药物的测定。但其敏感性和特异性低，不适合大批量样品的快速检测，而且由于其结果会出现假阳性，容易引起误判。

2 色谱检测技术

近年来，各种仪器联用等分析新方法的不断涌现，赋予色谱检测技术更加优良的分离分析能力。色谱检测技术已广泛用于各类食品中CAPs残留的测定。我国现行标准GB/T 22338-2008规定了动物源性食品中氯霉素类残留量的气相色谱-质谱（GC-MS）[9]和液相色谱-质谱/质谱（LC-MS-MS）[10]测定方法，适用于水产品、畜禽产品和畜禽副产品中氯霉素、氟甲砜霉素和甲霉素残留的定性确证和定量测定[11]。此外，其他色谱检测技术，如超高效液相色谱-串联质谱（UPLC-MS-MS）用于禽畜肉[12]、蜂蜜[13]、牛奶[14]、奶粉[15]和多种动物源性食品[16]中氯霉素的分析检测；高效液相色谱-电喷雾离子阱质谱法（HPLC-ESI-TRAP-MS）用于乳品中氯霉素类药物残留的测定[17]；气相色谱电子捕获法（GC-ECD）检测肌肉组织中的氯霉素残留[18]等。色谱检测技术具有灵敏度高、准确可靠等特点，但是样品前处理操作复杂、专业性强、成本较高，不适合进行大批量样品的快速筛选检测。

3 光谱分析技术

光谱分析技术是利用物质的特征光谱进行定性、定量和结构分析的技术。研究者分别使用可见光谱[19]、紫外光谱[20]及近红外光谱[21]对动物源性食品中的氯霉素残留进行了检测，结果表明，光谱分析技术具有成本低、操作简便的优点。但该法的选择性较低，而且近红外光谱法需要结合化学计量学技术进行数据解析，专业性强。

4 快速检测技术

快速检测技术通常具有灵敏快速、简便经济、适用于大批量样品快速筛选检测的特点，可以及时、快速地监控食品的安全状况，在食品和药物分析、临床诊断、环境保护等领域有着广泛的应用前景[22-23]。

4.1 免疫速测分析技术

免疫速测分析技术是基于抗原抗体特异性反应建立起来的快速检测技术[24]。其中，酶联免疫吸附法是目前应用最为广泛的免疫分析方法之一。近年来，毛细管电泳免疫等新免疫分析技术的加入为免疫快速检测提供了更广阔的发展空间。

4.1.1 酶联免疫吸附法

酶联免疫吸附法（ELISA）是一种以酶作为标记物的免疫分析方法。ELISA主要有夹心法、间接法和竞争法等测定方法。其中，夹心法和间接法主要用于测定抗体和大分子抗原，适用于临床诊断；竞争法主要用于测定小分子抗原，尤其适用于食品安全分析。程冰[25]选用竞争性酶联免疫吸附法分析了家禽可食组织器官中氯霉素的残留分布情况。郝俊虎等[26]用ELISA方法测定鸡组织中氯霉素的检出限为0.02 ng/mL，样品中不同浓度的氯霉素标准品回收率均达84.8％以上。Tajik等[27]采用ELISA和HPLC等方法测定鸡肝、鸡肾和肌肉组织内的氯霉素残留，结果表明ELISA法的检测结果与HPLC的检测结果基本一致。杨艳艳等[28]在建立氯霉素单克隆抗体（CAPmAb）杂交瘤细胞株和阻断ELISA方法的基础上，研制出CAP残留快速检测试剂盒（CAP-kit），并对其性能进行了测定。此外，目前市场上已出现一些商品化的试剂盒产品[29-30]，可以直接用于生产实践，适用于大规模氯霉素的残留筛选检测。

4.1.2 胶体金免疫层析法

胶体金免疫层析法（GICA）是基于免疫层析技术和胶体金标记技术建立起来的免疫分析方法。以胶体金作为着色物，应用于抗原抗体特异性免疫反应。免疫胶体金试纸法将特异的抗体交联到试纸条上，试纸条上有控制线和显示结果的测试线，样品中抗原与抗体结合后，胶体金可使该区域显示一定的颜色，通过与控制线颜色的对比实现快速检测。杨挺等[31]应用杂交瘤技术制备了抗氯霉素单克隆抗体，并根据竞争式胶体金免疫层析试验原理，研制了氯霉素检测免疫试纸条。研究结果表明，该单克隆抗体对氯霉素的亲合性好、特异性高；该金标试纸条适用于动物源性食品中氯霉素残留的快速检测，对虾肉、蜂蜜样品的最低检出限为1.5μg/kg；对鲜奶的最低检出限为3μg/kg，检测时间只需5min～8min。王玮[32]利用胶体金标记快速检测技术对氯霉素兽药残留快速检测方法进行了系统的研究。通过优化各项实验指标，建立了渗滤式（Flow-through）和层析式（Lateralflow）两种金标记免疫竞争快速筛选方法。以氯霉素与固相膜上的氯霉素-卵清蛋白（CAP-OVA）偶联物（即包被抗原）竞争结合金标记抗氯霉素多克隆抗体的方法，通过胶体金显色达到快速检测样品中氯霉素残留的目的。

4.1.3 化学发光免疫分析法

化学发光免疫分析法（CLISA）是一种有效的微量和痕量分析法，检测时间较ELISA短、灵敏度高、检出限低。高彬文等[33]采用CLISA法检测鱼和虾肌肉中的氯霉素残留，检出限为5.8×10-4μg/kg，比传统的ELISA方法更加灵敏快速、方便经济、不需要复杂的样品前处理过程。马玲等[34]采用一步式CLISA检测氯霉素残留，与常规两步式CLISA的检测效果相近，且耗时短，更符合快速检测的要求。

4.1.4 荧光免疫检测法

免疫荧光检测法（TRFIA）是将不影响抗原抗体活性的荧光色素标记在抗体（或抗原）上，与其相应的抗原（或抗体）结合后，在荧光显微镜下呈现一种特异性荧光反应。ZHANG等[35]首次使用TRFIA法测定猪组织中CAP残留的含量水平。此方法简便易行、灵敏度高，相比ELISA和气相色谱分析法明显缩短了测定时间。郭艳宏等[36]利用反相微乳技术合成了稀土铕-SiO2纳米颗粒，用其与氯霉素单克隆抗体结合制备氯霉素类残留物免疫检测探针，并制备荧光免疫层析试纸条，用于牛奶中氯霉素和氯霉素琥珀酸盐的同步检测。方法简便快速，具有较强的特异性。

4.1.5 毛细管电泳免疫分析法

毛细管电泳技术的发展及其在免疫分析上的逐步应用，使其发展成为一种新型的免疫分析技术，即毛细管电泳免疫分析法（CEIA）。张灿等[37]建立一种快速灵敏的氯霉素毛细管电泳免疫分析方法，对氯霉素检测的线性范围和最低检测限分别为0.008μg/L～5μg/L和0.001 6μg/L，与相应的固相ELISA相比，对氯霉素的检测灵敏度提高了约20倍，且缩短了分析时间。用该法对动物源性食物（牛奶、鸡肉和鱼肉）进行分析，得到氯霉素在实际样品中的检出限为0.035μg/kg。

4.1.6 微珠芯片免疫法

张东等[38]采用微珠芯片免疫分析法快速定量检测食品中的氯霉素残留。玻璃微珠经过表面化学修饰后形成氨基化表面，在碳二亚胺（EDC）催化作用下固定琥珀酸氯霉素，随后加入氯霉素单克隆抗体和氯霉素标准品或待测样品的混合物，待抗体抗原完全反应后加入荧光标记二抗示踪。绘制氯霉素浓度与荧光信号强度的标准曲线，然后根据标准曲线对待测样品中氯霉素进行定量分析。该方法具有良好的灵敏度、准确度和精密度，符合快速、高通量检测氯霉素残留的要求，并为实现介观流控免疫分析提供了基础。

4.2 传感器检测技术

传感器是能感受规定的被测量并按照一定规律转换成可用信号的器件或装置，通常由敏感元件、转换元件及测量电路组成。根据传感器的工作原理，可将其分为物理传感器、化学传感器和生物传感器三大类。在氯霉素类抗生素残留快速检测领域应用较多的是生物传感器和化学传感器。

4.2.1 生物传感器

生物传感器是利用生物活性物质的选择性识别作用进行测定的传感器，因具有灵敏度高和特异性强等优点而成为近年来的研究热点[39-42]。根据生物识别元件的不同，生物传感器可分为酶传感器、免疫传感器、微生物传感器等。其中，免疫传感器备受研究者的关注。宋巍巍等[43-45]在间接竞争ELISA的基础上，建立了以碱性磷酸酶（ALP）-对硝基苯磷酸（pNPP）为反应体系的检测CAP残留的伏安免疫方法，并对此法的电化学条件进行了详细的探讨。结果表明，用电化学免疫传感法测试CAP的灵敏度高于传统的间接竞争ELISA法，传感器体积小、便于携带、操作简单，可实现牛乳样品中CAP残留的现场检测。武会娟等[46]将pH敏感的荧光物质F1300标记到色素体的内表面，然后将β亚基抗体-生物素-链亲和素-生物素-氯霉素抗体系统连接到色素体上F0F1-ATPase的β亚基上，该检测体系能与氯霉素相连接。采用微弱发光检测仪检测荧光值，根据荧光值确定氯霉素浓度，检出限为0.01ng/L，检测操作仅需35min，能快速、灵敏地检测氯霉素，具有很好的应用前景。

此外，将适配体作为生物识别元件的适配体生物传感器近期已被用于氯霉素的快速检测。Pilehvar等[47]基于非标记适配体的折叠/去折叠作用开发了一种新型的适配体传感器。将人工核酸配体寡核苷酸适配体（ssDNA或RNA）自组装到金电极表面，这种寡核苷酸适配体能够准确识别CAP。在CAP存在下，去折叠的ssDNA在电极表面折叠成为一种发夹结构，使目标分子接近电极表面而发生电子转移。该传感器具有良好的选择性，氯霉素结构类似物甲砜霉素和氟甲砜霉素不影响CAP的测定，检出限达1.6 nmol/L。

4.2.2 化学传感器

化学传感器是利用电化学反应原理，把各种化学物质的浓度转换为电信号进行检测的传感器。Pilehvar等[48]在甲砜霉素和氟甲砜霉素存在的情况下，以金电极作为工作电极，通过选择检测电位，实现了氯霉素的高选择性检测，检出限为1.0μmol/L。康金国等[49]用聚乙烯亚胺-纳米金修饰玻碳电极，建立了检测牛乳样品中氯霉素残留量的电化学方法，检测氯霉素的回收率达96.8％，准确率达99％以上，平均每份样品的检测时间为4min。

享有“塑料抗体”美誉的分子印迹聚合物可以作为识别元件研制分子印迹仿生传感器。张挪威等[50]采用光聚合法在一次性丝网印刷电极上制备琥珀酸氯霉素分子印迹膜，然后将电极通过电极插口与电化学分析装置相连接，组装成检测琥珀酸氯霉素残留的电化学传感仪，并测试了实际牛奶样品中的氯霉素含量。该法具有很高的灵敏度和特异性，检出限为2 nmol/L，基于牛奶样品的检测回收率介于93.5％～95.5％之间。

4.3 生物芯片

生物芯片是根据生物分子间特异相互作用的原理，将生化分析过程集成于芯片表面，从而实现对细胞、蛋白质以及其他生物活性成分的高通量快速检测。根据固定在载体上的物质成分，生物芯片可分为基因芯片、蛋白质芯片、细胞芯片、组织芯片等。左鹏等[51]使用蛋白芯片法快速定量检测食品中的氯霉素和磺胺二甲嘧啶残留。将氯霉素和磺胺二甲嘧啶人工抗原固定在芯片上，在芯片反应区内加入氯霉素和磺胺二甲嘧啶单克隆抗体和其标准品或待测样品混合物，待抗原抗体完全反应后加入荧光标记二抗示踪。通过检测荧光强度进行定量分析。方法简单快速、灵敏度高、重复性较好，适用于大规模氯霉素和磺胺二甲嘧啶的残留筛选检测。

悬浮芯片技术是一种新型的生物芯片技术，利用悬浮在液相中的荧光微球作为检测载体，具有高通量、灵敏快速、特异性强等特点。刘楠等[52]建立一种检测氯霉素和克伦特罗兽药残留的新型高通量悬浮芯片技术。2种兽药悬浮芯片的检测特异性好，与其他药物无明显交叉反应，检出限分别为40 ng/L和50 ng/L，为多种兽药残留的快速检测提供了新方法。

5 结语

随着科学技术的发展，分析检测水平不断获得提高，氯霉素类抗生素残留的检测新技术正在不断涌现，其主要发展趋势可以概括为：1）建立高灵敏度、高选择性的复杂仪器体系。如超高效液相色谱-串联质谱（UPLC-MS-MS）、高效液相色谱-电喷雾离子阱质谱法（HPLC-ESI-TRAP-MS）等；2）开发灵敏快速、自动智能的现场快速检测技术。如生物传感、生物芯片、酶联免疫法和胶体金免疫层析法等。其中，快速检测技术因具有成本低、简便经济、适用于大批量样品快速筛选检测等优点而备受研究关注，在氯霉素类药物残留分析、环境保护、临床诊断等领域有着广泛的应用前景。

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Research Progress in Fast Detection Techniques of Chloramphenicol Residues in Food

ZHANG Wei，ZHAO Xiao-juan*，CHEN Hai-guang
（College of Light Industry and Food Sciences，Zhongkai University of Agriculture and Engineering，Guangzhou 510225，Guangdong，China）

Food safety issues caused by the chloramphenicol（CAPs）residues have brought about increasing concern.In this paper，the conditions of CAPs residues of animal derived food are introduced.The development and application of detection techniques of CAPs residues was summarized since 2004.In particular，the fast detection techniques，such as immunity analysis methods and sensors，are focused.Finally，the development trend of detection techniques of CAPs residues is discussed.

food safety；chloramphenicol；residues；fast detection

10.3969/j.issn.1005-6521.2014.04.030

2012-11-30

国家自然科学基金项目（21005091）；广东省教育厅科技创新项目（2012KJCX0068）；广州市食品安全检测技术重点实验室（[2011]233-44）

张威（1986—），男（汉），硕士研究生，研究方向：食品安全。

*通信作者：赵晓娟（1980—），女，副教授，博士。