乳酸菌能量代谢的蛋白质组学研究进展

刘海新

（青岛科技大学化工学院，山东 青岛266042）

乳酸菌是非常有趣的生物体，约3亿年前，它们起源于厌氧到需氧的过渡时期，并且在演化过程中从未获得过合成血红素的能力。存在于细胞色素、过氧化物酶和过氧化氢酶中的卟啉可使它们进行有氧和无氧呼吸及氧自由基的解毒作用。乳酸菌的病原菌种，即链球菌，可以通过来自动物宿主的溶血素混入细胞色素来减少血红素，从而获得减少氧气及加快新陈代谢的功能性呼吸链，其它乳酸菌物种则被迫生活在具有较低能量的发酵代谢中。与厌氧细菌不同的是，乳酸菌在氧气中也可以存活[1］。由于缺乏血红素，它们抵抗氧气的防御机制主要是以金属的积累为基础。事实上，有些乳酸菌物种能够在细胞内积累大量的锰（可达25mmol）、硒和锌。锰可以充当类似超氧化物歧化酶的角色，而硒可以在硒代胱氨酸系统中充当自由基清除剂，锌构成了氧自由基的离子捕集器。所有这些能力使乳酸菌成为耐氧的厌氧菌，也为其凭借肠道环境中的金属浓度成为有益菌种提供了可能。某些异型发酵的乳酸菌物种可以通过一个简短的电子传输链（NADH－黄素－O2）将氧气还原为水，从而消除氧气，并最终通过乙酰磷酸产生的醋酸将NADH重新氧化为NAD＋，从而维持了系统的循环。

由于乳酸菌的生物合成能力有限，因此它们可以与为其提供糖类、维生素和氨基酸的动植物形成共生或寄生关系。另外，乳酸菌可以生活在食物生态环境中，因而普遍存在于水果、蔬菜、奶酪、葡萄酒，特别是牛奶中。牛奶因为含有丰富的乳糖，从而成为乳酸菌首选的生活环境。异型发酵乳酸菌可以产生100%的乳酸，兼同型和异型发酵的乳酸菌可以产生乳酸、乙醇和乙酸。在兼同型和异型发酵的乳酸菌中，1mol戊糖发酵代谢可以多产生2mol ATP。同型发酵的乳酸菌可以从己糖中获得2mol ATP，而异型乳酸菌只能得到1mol ATP[2］。除了底物磷酸化，一些乳酸菌还可以从质子运输中获得能量。

乳酸菌具有悠久的历史、显明的特征及与人类生活息息相关等特点。正是凭借这些特点，乳酸菌受到了各国科研人员的关注，近年来相关研究成果层出不穷。特别是最近几年，利用蛋白质组学作为研究工具对乳酸菌进行研究更是成为了生物、医学界关注的热点。作者在此概述了乳酸菌能量代谢的蛋白质组学研究进展，并讨论了代谢路径之间的相互关系。

1 乳酸菌替代能源途径的影响因素

由于乳酸发酵是乳酸菌获得能量的主要途径，因此在同型乳酸菌物种和可以产生醋酸的异型乳酸菌物种中，减小pH值十分必要。在某些物种中，pH值减小可以通过质子或底物的同向运输来实现，系统产生电子并排出质子，但不能在低pH值下工作，因为乳酸的pKa是3.9，低于此值时乳酸不能解离，只可以通过被动扩散排出，每摩尔乳酸只能排出1个质子[3］。低pH值可能诱发其它系统来缓冲乳酸的酸性，如氨基酸脱羧或ADI途径等。

1.1 氨基酸脱羧反应对pH值的控制

在大肠杆菌中，细胞外的低pH值将引起cad编码操纵子由赖氨酸转换为尸胺，并引起谷氨酸转化为氨基丁酸谷氨酸脱羧酶[4］，在这些比乳酸菌演化更高级的革兰氏阴性菌中，氨基酸脱羧路线的活化与能源需求没有必然的联系，因为还有其它可供选择的发酵途径。因此，氨基酸脱羧反应的主要生理功能是控制pH值，例如为了在胃管道中存活而调节pH值。乳酸菌中氨基酸的脱羧反应至少在3个水平上进行pH值调节：微生物种群的筛选、脱羧酶的催化活化和脱羧酶合成的过度表达。

1.2 ADI途径

和氨基酸脱羧反应类似，人们发现葡萄酒中的乳酸菌的ADI途径也可被不同的酸性pH值（pH＞3.2）激活。由此路径产生的氨气，有助于细胞承受低pH值（pH＜4）及保护口腔链球菌[5－6］、乳酸菌和酸性应力下的干酪乳酸球菌。相比之下，在酵母株乳酸菌Sanfrancisciensis中观测到不需要控制pH值的ADI途径表达。

1.3 乳酸发酵

乳酸发酵通常在pH值呈酸性（pH值为3左右）时进行。Gockowiak和Henschke指出，L－苹果酸的降解速率在pH值为3.5和2.9时分别以每周3.1g·L－1和8.0g·L－1的速率急剧下降。Rosi等[7］也发现乳酸菌的代谢活性在pH值为3.2时会下降，因为pH值为3.2时苹果酸的完全降解需要15d，而pH值为3.6时只需10d。

1.4 ATP的控制

促进ATP合成的条件不利于 ADI的途径[8］。ATP浓度和乳酸乳球菌的氨基甲酸酯类激酶的生物合成之间的反比关系表明，ADI途径是在ATP衰竭的情况下被激活的[9－10］。有假设认为即使ATP不足，三磷酸腺苷和精氨酸也可以通过促进扩散或利用低pH值条件下的跨膜质子梯度进入细胞。

1.5 生长期的控制

将不同生长期当作同一参数来评估路径的激活是不正确的。事实上，在每个阶段各种复杂因素在不同程度上发挥作用，这取决于培养基条件、媒介、菌株、养分供应和辅源营养等等。Pessione等通过胺测定和蛋白质组学研究，检测到组胺的过度积累与乳酸杆菌稳定生长期的HDC的过度表达相关联。对乳酸乳球菌NCDO2118中γ－氨基丁胺的研究也得到了类似的结果。

2 碳底物对乳酸菌能量代谢的影响

除了pH值降低和ATP减少之外，人们认为激活普通有机酸和氨基酸产能反应的另一个因素是碳水化合物不足。而对于MLF、氨基酸脱羧和ADI途径中糖类的影响，文献中却显示出相反的结果。从物种到物种（有时从菌株到菌株）之间存在着巨大的差异[11］。

2.1 氨基酸脱羧反应

糖类可以影响氨基酸脱羧路径。Lonvaud－Funel等[12］研究表明，发酵糖的不足可以提高澳球菌中组胺生产量。随后Rollan证实澳球菌中葡萄糖的量不影响HDC的催化过程，由此引入了对HDC操纵子进行生物合成的假说。最近，Pessioneet等对Lactobacillus菌种的研究表明，葡萄糖耗尽时存在HDC的诱导。此外，虽然糖消耗能增强组氨酸脱羧作用且不发生酪胺积累，但对L.hilgardii和P.parvulus的研究已明确证实了葡萄糖和果糖对HDC编码操纵子的抑制作用。糖在氨基酸脱羧途径中的影响尚未完全明确，初步推断，它与特定的氨基酸、氨反应及与不同菌种的关系似乎比其它微生物物种更加密切，因为L.hilgardii同时具有两种现象。

2.2 ADI途径

1987年，Poolman等[9］在乳酸乳球菌的ADI酶生物合成途径中进行了葡萄糖的阴性对照研究，结果表明，cAMP的拮抗与分解抑制是相兼容的。在果糖加蔗糖和葡萄糖加乳糖中，链球菌和乳酸菌Leichmanii得到了相似的结果。微生物的合成抑制和负催化调控已经通过乳酸球菌与L.buchneri中3个主要的ADI途径酶（ADI、OTC、CK）得到证实。尽管在L.sakei中已发现，但负合成调控在这些研究结果中可能是由于物种或菌种差异引起的，ADI途径的最终结果可能是合成和催化调节的共同结果。Jonsson和de Angelis等对L.plantarum、L.buchneri和Sanfrancisciensis的研究证明了葡萄糖在ADI途径中发挥作用。这些研究表明要激活ADI途径，少量的葡萄糖是必需的。pH值较高时，精氨酸才可以进入细胞，并在精氨酸操纵子作用下发挥其激活作用。然而，仍不能解释为什么都能产生能量及不同的糖（果糖、蔗糖、乳糖、半乳糖）或高血糖浓度却产生相反效果等问题。

2.3 苹果酸－乳酸发酵

乳酸菌中糖的代谢和苹果酸－乳酸发酵之间的关系并没有得到广泛研究。Davies等观察到，澳球菌生长中，在存在葡萄糖、果糖和苹果酸的情况下，苹果酸是同时与乳酸产生及消耗的，然而葡萄糖和果糖均不减少。这表明，碳底物酸和糖同时存在时，细菌倾向于通过苹果酸－乳酸发酵消耗苹果酸。其它研究也表明，在没有发酵糖的苹果酸合成培养基中乳酸菌不能生长。因此，作为MLF唯一补充碳源，尽管L－苹果酸可以为利用底物补充能量，但它不能作为增长过程的唯一碳源。Landete等还观察到苹果酸乳酸酶的表达可以被葡萄糖激活，而苹果酸酶基因的表达却被葡萄糖抑制[13］。

3 结语

乳酸菌中产生能量的蛋白质网络比以前人们认为的要复杂得多。利用尖端的技术，如转录、蛋白质组学研究发现，生物合成调控是普遍存在的，而催化控制至关重要，调节基因表达往往存在不同的路线。此外，蛋白水解系统和蛋白激酶是相互协作的，它们一起抵制能量产生过程中pH值的变化等，这是乳酸菌通过漫长的进化所得到的结果。

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