microRNA与乳腺癌耐药相关性的研究进展

史 敏, 吕建鑫, 潘 波, 王晓军, 戴璐娴, 杨晓红, 付子毅, 谢 晖

(1. 江苏省扬州市妇幼保健院 乳腺科, 江苏 扬州, 225002; 2. 南京市妇幼保健院, 江苏 南京, 210004)

microRNA(miRNA)是一类长度约21～25 nt的非编码RNA, 在转录后水平调控靶基因的表达[1-2]。miRNA的成熟包括在胞核及胞质中的加工过程，在核酸内切酶Drosha作用下，miRNA的编码基因由RNA聚合酶Ⅱ转录形成具有茎环结构的RNA由核内输出，经Dicer酶加工形成成熟的miRNA，与Argonaute蛋白结合形成RISC(RNA-induced silencing complex, 基因沉默复合体)，进而调控靶基因的表达[3-4]。miRNA与靶基因的3′-UTR区结合，导致mRNA降解和/或翻译抑制，下调靶蛋白的表达，从而达到调控靶基因表达的目的[5]。事实上, miRNA调节了约30%的蛋白编码基因，并参与多种生物学功能的调控，包括细胞增殖、凋亡及分化[6]。因此, miRNA的功能异常与多种人类疾病有关，包括肿瘤[7]在内。近年研究[8]表明, miRNA与多种实体肿瘤的耐药性密切相关。经对乳腺癌细胞耐药株及敏感株的研究，证实多种miRNA对乳腺癌多药耐药具有调控作用[9-14]。

1 miRNA调控乳腺癌耐药的机制

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤，全球每年约有1.4亿新发病例，约有46万妇女死于乳腺癌，是导致患癌症妇女死亡的首要原因[15]。近年来，我国女性乳腺癌发病率逐年显著递增，远高于其他国家，并趋于年轻化，严重威胁女性的生命健康和生活质量[16]。尽管在过去20年间，通过对疾病筛查的普遍实施和新的治疗方法的发展，西方国家的乳腺癌死亡率显著下降，但对这些治疗方法的耐药成为越来越严重的问题[17]，据报道[18]约有90%的乳腺癌患者最终死于耐药。乳腺肿瘤对结构和功能不同的化疗药物均可能产生多药耐药(MDR), 明显影响化疗效果。MDR是指肿瘤细胞在接触一种抗肿瘤药物并产生耐药的同时，对结构、功能及杀伤机制迥异的多种抗肿瘤药物具有交叉耐药，是最重要的耐药形式之一。最新研究[19]表明，MDR已成为乳腺癌治疗失败的关键因素。

Iorio等[20]于2005年首次发现，miRNA在乳腺癌和正常乳腺组织中表达存在显著差异。Ryu等[21]在MCF-710A、MCF-7及MDA-MB-231等不同乳腺癌细胞株中鉴定出189种表达明显异常的miRNA，且这些miRNA均有不同程度的致癌潜能。后续研究发现，多种miRNA与乳腺癌耐药相关, miR-221/222在他莫昔芬耐药的细胞中低表达[22], miR-328在米托蒽醌耐药的细胞中低表达[23], miR-125在紫杉醇耐药的细胞中高表达[24]等等。这些证据充分说明: miRNA的表达异常是乳腺癌耐药细胞的一个重要特征，与乳腺癌耐药有着极其密切的关系。miRNA对乳腺癌耐药的调控机制十分复杂，目前并未完全阐明。现今较明确的机制主要包括调节ABC转运蛋白的表达、调节凋亡通路、调节药物代谢酶的表达及调节肿瘤干细胞的形成等。

1.1 miRNA对ABC转运蛋白的调节

乳腺癌患者产生MDR的最主要原因是由药物外排增加、细胞内药物浓度下降所致[25]。药物外排增加受ABC转运蛋白调节，其在预后较差的乳腺癌各亚型中均表达显著增加[26]。P糖蛋白(P-glycoprotein)是ABC转运蛋白中研究最为透彻的与药物外排有关的蛋白，与紫杉烷类及蒽环类化疗药物耐药密切相关。P-gp由MDR1基因(ABCB1)编码，可以转运多种分子结构，这即意味着只要对一种化疗药物耐药，通常就会对多种结构不同的药物耐药。研究[11，27]表明，miR-27a、miR-451可能上调多药耐药基因MDR1及其产物P-gp的表达。另有多项研究显示，miRNA能以ABC超家族的多个成员如ABCB、ABCG、ABCC等为靶基因，对肿瘤细胞耐药性进行调控。Pan等[10]研究发现, miR-328在乳腺癌细胞中与ABCG2的表达呈负相关，耐药细胞株MCF-7/MXl00中, miR-328表达显著下调，而ABCG2表达显著上调，导致细胞对米托蒽醌耐药。Zhou等[24]为进一步阐明miR-328的调控机制，分别检测转染miR-328的MCF-7/MXl00细胞、转染miR-328拮抗剂的MCF-7细胞以及破坏ABCG2 3′-UTR区相应miR-328反应元件(MRE)的MCF-7细胞等的ABCG2 3′-UTR的荧光素酶活性，发现其分别下降50%以上、上升100%及上升3倍，这充分证实miR-328是通过与ABCG2 3′-UTR区相应的MRE特异性结合，进而负调控ABCG2的表达。之后的研究[9]证实, miR-519c和miR-520h通过靶向作用于ABCG2 mRNA的3′-UTR区进而调控其蛋白的表达。Pelletier等[14]通过对乳腺癌患者ABCG2 3′-UTR区的检测，发现miRNA可干扰其多态性，增强与3′-UTR区的结合作用进而影响乳腺癌的MDR。后续研究还发现更多的miRNA以类似机制调控耐药相关蛋白的表达，如miR-451可负调控P-gP[11]、miR-326、miR-345和miR-7等，均可负调控多药耐药蛋白1(MRPl/ABCC1)[13, 28], 与乳腺癌对阿霉素、依托泊苷以及顺铂等化疗药物耐药性的形成密切相关。miR-200c[29]和miR-298[30]在耐多柔比星乳腺癌细胞中均低表达，当提高其表达量时，可增加乳腺癌细胞对多柔比星的敏感性并降低MDR1/ABCB1及P-gP的表达，从而提高细胞内多柔比星药物浓度。说明miRNA通过调节ABC转运蛋白的表达，从而造成细胞内药物外排、胞内药物浓度下降而致乳腺癌细胞耐药性增强。

1.2 miRNA对细胞凋亡通路的调控

细胞抗凋亡能力的提高是肿瘤细胞多药耐药产生的重要机制之一[31]。抗肿瘤药物通过介导内源性或外源性凋亡反应而使肿瘤细胞死亡。miRNA可通过调控凋亡通路相关蛋白表达，进而影响乳腺癌细胞对化疗药物的敏感性。Bcl-2是重要的抗凋亡蛋白，其表达水平与乳腺癌耐药细胞中相关的miRNA表达水平密切相关。Cittelly等[32]研究发现，Bcl-2的表达水平与miR-15a、miR-16的表达水平在MCF-7/HER2Δ16细胞中呈负相关，通过分别转染miR-15a和miR-16后, Bcl-2的表达水平显著降低，细胞对他莫昔芬的敏感性显著增强；而通过沉默miR-15a和miR-16, 使Bcl-2的表达显著增加，细胞的抗凋亡能力及对他莫昔芬的耐药性均显著增强，提示miR-15a、miR-16通过下调Bcl-2的表达，进而调控乳腺癌细胞MCF-7/HER2Δ16耐药性的形成。另有研究[34]证实，miR-125b、miR-221、miR-222和miR-923在耐紫杉醇乳腺癌细胞中高表达，并发现miR-125b与Bcl-2的表达水平呈正相关，均高表达，其机制为miR-125b通过抑制促凋亡基因Bak1(Bcl-2 antagonist killer 1)的表达致细胞内Bak1的表达水平显著降低，Bak1对Bcl-2的拮抗作用显著降低，Bcl-2表达水平上调，细胞抗凋亡能力增加，对紫杉醇耐药性增加。Ru等[33]发现miR-203可直接负调控细胞因子信号抑制因子3(SOCS3)的表达，进而降低了p53、p21、Bax等促凋亡蛋白的表达，使药物介导的细胞凋亡作用明显受抑制，引起乳腺癌细胞对顺铂的耐药；而敲除乳腺癌细胞miR-203基因后，其对顺铂的敏感性显著增加。而Kong等[34]的研究证实，miR-155通过调控转录因子FOX03a的表达使乳腺癌细胞对紫杉醇及多柔比星耐药，而FOX03a的下游靶点均参与了细胞凋亡进程。Gong等[35]研究证实, miR-21表达上调使乳腺癌细胞对曲妥珠单抗治疗耐药，进一步研究证实其使同源性磷酸酶-张力蛋白基因(phosphatase and tensin homolog, PTEN)表达缺失，从而导致了肿瘤细胞的凋亡受抑制。以上研究均表明，在乳腺癌细胞中，miRNA可以通过调控细胞凋亡而介导乳腺癌细胞耐药，这可能也是乳腺癌耐药性形成的重要原因之一。

1.3 miRNA与药物代谢酶

药物代谢加快与乳腺癌患者对治疗反应减弱关系密切[36]。细胞色素P450(CYP450)酶家族是催化药物代谢反应的关键酶，超过80%的临床常用药物是经由CYP450代谢清除的。miRNA可以通过负调控药物代谢酶CYP450家族中的CYP3A4、CYP1B1等成员的表达，进而调控乳腺癌的耐药性。Tsuchiya等[37]在乳腺癌细胞MCF-7中证实miR-27b在转录后水平调节CYP1B1的表达，同时通过对24位乳腺癌患者癌组织及邻近非癌组织的研究发现, miR-27b在乳腺癌组织中低表达，并伴随CYP1B1蛋白的显著高表达。另有研究证实, miR-27b[38]、miR-148a[39]抑制CYP3A4的表达。而CYP1B1[40]、CYP3A4[41]是乳腺癌对多西他赛耐药的预测因子, CYP1B1、CYP3A4阳性乳腺癌对多西他赛的敏感性较阴性者显著降低。而这些miRNA在乳腺癌耐药细胞中均表达明显降低，致CYP3A4、CYP1B1等表达增加，细胞内化疗药物迅速代谢，难以维持胞内有效浓度，进而引起细胞耐药。

1.4 miRNA与乳腺癌干细胞

目前，乳腺癌干细胞(BCSC)的耐药性已得到普遍的证实。而miRNA的异常表达能诱导BCSC的形成、有助于干细胞特性的维持，可能是BCSC耐药性形成过程中的重要的调控因子。Shimono[42]和Iliopoulos[43]等研究均发现，miR-200家族在BCSC中表达水平显著下降，而miR-200b的表达上调会阻断BCSC的形成并干扰其特性的维持，从而显著增强化疗药物对肿瘤生长的抑制作用; miR-200b在细胞内的表达水平下降则能显著诱导BCSC的形成。miR-128[44]在耐药性乳腺癌初始细胞中表达水平显著下降，导致Bmi-1及ABCC5过表达，而显示干细胞特性，并可抑制阿霉素介导的细胞凋亡和DNA损伤作用，产生耐药；当上调BCSC中miR-128的表达水平时，能够显著逆转BCSC对阿霉素的耐药性。而Bmi-1过表达的细胞具有明显的干细胞特性，并证明对顺铂及培美曲塞耐药[45]。

2 miRNA在乳腺癌耐药中的应用前景

2.1 miRNA与乳腺癌耐药的预测

如果能够利用miRNA的检测进行乳腺癌的诊断及其耐药性的分析，对于乳腺癌的临床治疗具有重要意义。Zhu等[46]发现，几乎所有体液中均可以检测到miR-16、miR-145和miR-155的表达。而Lodes等[47]更进一步证实，在1mL血浆中即可获得足够的可供检测的miRNA，同时可用于判断是正常组织还是肿瘤组织。这些充分说明外周血液中miRNA表达谱的检测对乳腺癌的诊断及耐药性的预测是有可能实现的。

2.2 miRNA与乳腺癌耐药的治疗

乳腺癌细胞耐药性的形成与细胞内miRNA的异常表达密切相关，通过改变肿瘤细胞内相关miRNA的表达水平，逆转乳腺癌的耐药性是一种潜在的治疗策略。诱导miRNA的再表达，多采用引入合成的短双链RNA分子(即miRNA模拟物)的方式，在临床前期动物实验中，以病毒、脂质体及靶向纳米颗粒为载体的转染显示了良好的作用及耐受性[48]。Kim等[49]将含有miR-145的腺病毒转入人乳腺癌细胞株和乳腺癌小鼠模型体内，发现能有效抑制乳腺癌细胞生长，并且Ad-miR-145与5-Fu联合使用疗效明显高于单独使用时的疗效。Bourguignon等[50]采用特异性的anti-miR-21序列沉默MCF-7细胞内过表达的miR-2l后，能有效阻断HA-CD44介导的肿瘤细胞抗凋亡、耐药等行为的形成。

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