胶原蛋白/丝素蛋白的理化性质及静电纺胶原/丝素复合材料在骨组织工程中的应用

张振辉，陈旭义，李晓寅，杨晓青，徐云强

(1天津医科大学总医院，天津300052;2武警后勤学院附属脑科医院)

骨损伤、骨缺损等由于移植物来源短缺或移植后存在多种不良反应等因素，治疗上非常困难，成为骨科领域亟待攻克的难题。目前临床治疗方法主要包括内源性骨修复和外源性骨修复两种。内源性骨修复仍是骨缺损修复的金标准，一般从身体另一部位取出健康骨后移植到损伤部位，其局限性在于骨源短缺，且往往需要二次手术;外源性骨修复虽克服了骨源短缺的缺点，但存在移植体组织相容性及容易引发感染等问题。骨组织工程学的发展改变了传统的治疗模式，其目的是利用工程学和生命科学的原理和方法再生新的骨组织，以修复和替代病变或缺损骨组织。骨组织工程以种子细胞、支架材料、细胞因子作为三要素来构建三维空间复合体，其中支架材料尤为重要，能提供细胞基质、维持细胞生长并保持其分化功能，提供暂时的力学支撑，从而满足组织修复和重建的要求［1］。随单一材料支架缺点的不断暴露，将两种或两种以上材料混纺成复合材料以实现其结构和功能上互补的方法，有望在支架材料研究领域展现创新性和实用性。本文就胶原蛋白/丝素蛋白的理化性质及静电纺胶原/丝素复合材料在骨组织工程中的应用综述如下。

1 胶原蛋白/丝素蛋白的理化性质

1.1 胶原蛋白 胶原蛋白是动物结缔组织的主要结构成分，不同种类动物来源的胶原具有非常相似的化学和生物学特征。胶原蛋白具有较低的免疫原性、良好的生物相容性及生物可降解性，而且来源广泛，是应用最早的天然生物材料。骨组织中主要含Ⅰ型胶原和透明质酸，是正常骨组织的主要有机成分。其中Ⅰ型胶原与成骨细胞表面特异性受体α整合素亚单位紧密结合，可促进成骨细胞的黏附、增殖、分化;胶原表面还含有沉积矿物位点，对矿物沉积具有诱导作用。Rammelt等［2］研究发现，Ⅰ型胶原还可提高成骨细胞的成骨能力，刺激骨髓间充质干细胞向成骨细胞转化。但是以单纯胶原蛋白为材料所构建的组织工程支架降解速度较快、机械强度较差，不能满足种子细胞支架的要求［3］。要克服胶原蛋白作为组织工程支架材料的缺点，除对胶原蛋白本身进行改良及加工外，还需寻找性质互补的天然高分子材料。

1.2 丝素蛋白 丝素蛋白是一种含有人体必需氨基酸的天然蛋白质，具有良好的生物相容性和力学性能，且降解缓慢。丝素蛋白由蚕丝经过脱胶制得，是一种无生理活性的天然高分子纤维蛋白，占蚕丝的70% ～80%，含18种氨基酸，其中甘氨酸(Gly)约占46%、丙氨酸(Ala)约占29%、丝氨酸(Ser)约占12%。丝素蛋白由重链(H链，相对分子质量350 kD)、轻链(L链，相对分子质量25.8 kD)及糖蛋白p25(相对分子质量23.55 kD)、3个寡糖链组成，其中H链和L链分别由各自c-末端的二硫键连接形成复合体，以1∶1的比例存在;糖蛋白p25以非共价键与H链和L链相连接［4］。另外，丝素蛋白存在SilkⅠ和SilkⅡ两种不同的构象，Silk I构象包括无规则线团和 α-螺旋，SilkⅡ构象则为反平行 β-折叠［5］。其中SilkⅠ结构不够稳定，经极性溶剂、热处理等可转变成稳定的 SilkⅡ结构［6］。Vepari等［6］与 Altman 等［7］认为丝素蛋白主要优点如下:具有其他天然纤维无法比拟的力学性能和柔性;对水和氧通透性好;可通过相对简单的处理获得多种不同的形态;有利于组织细胞长入，体内外均降解缓慢。基于上述优点，多孔丝素蛋白在骨组织工程支架中的应用研究日趋得到发展。

Sofia等［8］通过在丝素纤维上培养造骨细胞、成纤维细胞和骨髓细胞，证实丝素肽链中含有促生长因子Arg(R)-G1y(G)-Asp(D)肽，相对于其他人工骨材料更有利于骨细胞的黏附生长;将RGD肽引入丝素蛋白膜表面后能显著提高材料的骨诱导性［7］。Meinel等［9］首次将丝素蛋白制备成三维多孔支架用于骨组织工程研究，先将人间充质干细胞(hMSC)种植在支架上，然后植入鼠颅骨创伤模型，在5周内能够观察到诱导骨形成，说明丝素蛋白能用于骨重建和再生，并且表现出良好的力学稳定性和持久性。骨形态发生蛋白(BMP)是存在于骨基质中的一种酸性蛋白质(最早用于诱导骨再生的因子)，能在体内及体外诱导骨髓基质细胞转化为成骨细胞和软骨细胞。Kim等在制备丝素蛋白支架材料过程中加入聚天冬氨酸并暴露在磷酸氢二钠和氯化钙中控制磷酸钙的沉积，其后在这种矿化的蛋白复合材料支架上种植hMSC，体外培养6周后见丝素蛋白多孔支架中磷灰石和BMP-2初始含量及成骨增加，表明预先矿化处理的多孔丝素蛋白支架可用于骨组织工程。研究表明，胶原中加入少量丝素蛋白后其干态下的机械物理性能改善，包括膜的力学性能及抗水性能提高、热水溶失率降低，对成纤维细胞、皮肤表皮细胞具有较好的黏附性。从生物降解方面来讲，丝素蛋白缓慢的降解速度能为细胞提供长久的支持，以更好的匹配组织细胞的生长速度，而且可经过不同的处理方法达到不同的形态和孔隙要求。

2 静电纺胶原/丝素复合材料及其在骨组织工程中的应用

静电纺丝(简称“电纺”)技术由Fonnhah等在1934年首创，是一种在高压电场作用下形成超细纤维的聚合物加工技术。以此技术制备的微纳米纤维支架具有非常高的比表面积、孔隙率以及相互连通的三维网络结构。相对于传统技术，电纺技术制备的支架材料能更好地模拟天然细胞外基质的结构特点并为种子细胞的生长提供好的微环境，在组织再生与修复领域有相当广阔的应用前景［10］。但电纺技术制备的胶原/丝素纤维膜耐水性仍有不足，在水溶液中有一定溶解性，难以保持其纤维形态，故需在密闭干燥器中用25%戊二醛水溶液蒸汽对其进行交联。研究［11］证实，交联后的材料在力学性能、稳定性及细胞黏附性方面均显著提升。美国塔夫斯大学Li等通过体外实验发现，静电纺丝素蛋白纤维支持hMSC的生长及向成骨细胞的分化，且该材料有助于提高骨形成。

骨组织工程材料作为人体支撑结构的替代物，需要有良好的力学性能。理想的组织工程支架材料至少应满足以下要求:具有良好的生物相容性;与神经再生匹配的降解速度;良好的材料—细胞作用界面(利于细胞的黏附与增殖);适宜的孔隙率和一定的力学强度(以提供种子细胞渗透和新生组织生长繁殖);良好的可塑性(可根据需要加工成适宜的形状和大小)。目前用作组织工程支架的生物降解材料主要有人工合成的高分子物质(如聚乳酸、聚羟基乙酸以及两者的共聚物)及天然高分子物质(如胶原蛋白、丝素蛋白、壳聚糖、海藻酸盐等)［12］，前者具有来源不受限制、可调控降解时间、物理机械性能较好等特点，但存在细胞亲和性较差、降解速度慢等问题，且在体内长期存在易引起宿主组织炎症及肿胀等缺陷;后者具有生物相容性好、毒副作用小、易降解、降解产物易吸收的优势，在组织工程支架材料的研究中备受青睐。Park等用丝素蛋白制作出纳米级三维多孔支架，在支架上种植MC3T3-E1成骨细胞，利用 DNA计数和四甲基偶氮唑盐比色法(MTT)分析细胞增殖及新陈代谢能力，结果发现细胞生长良好，把支架移植入骨损伤小鼠体内7 d后骨损伤完全恢复。说明丝素蛋白和电纺技术在骨组织工程研究和应用上是有潜力的。

刘和风等［13］构建了丝素—胶原复合物半月板支架，并将体外培养的兔半月板纤维软骨细胞接种在该支架上，再加入转化生长因子(TGF)-β行三维立体培养，结果显示纤维软骨细胞能良好地贴附于支架孔壁上，提示该支架的细胞相容性良好。

目前，虽然骨组织工程支架材料的研究取得一些进展，但广泛应用于临床尚有一定距离。在不断寻求新型骨支架材料的同时，采用复合手段制备理想骨支架材料可能是一种更加有效的途径。采用电纺技术制备的胶原/丝素复合材料，其胶原微纳米纤维理化性能明显改善，原因为戊二醛蒸汽的交联作用增加了蛋白分子间的相互作用，使纤维膜的强度明显升高;而丝素本身的力学性能也高于胶原，因此两者复合后强度提高。故在充分结合胶原蛋白的良好生物相容性和丝素蛋白优异机械性能的基础上，所构建出的胶原/丝素复合材料满足骨组织工程的支架要求。随着研究的深入及技术的不断完善，静电纺胶原/丝素复合材料有望作为一种新型的骨组织工程支架材料在临床得以应用。

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