类风湿关节炎患者血浆Ghrelin水平变化及其基因C408A多态性分析

杨梅花，王向红，冯忠军，米 娇，张志红

(1石家庄市第一医院，石家庄050000;2石家庄市第六医院;3河北医科大学第三医院)

Ghrelin是1999年日本科学家Kojima从大鼠胃中分离出来的一种活性多肽，含28个氨基酸，是促进生长激素受体活性的内源性配体，故又称生长激素［1］。近年研究［2］发现，Ghrelin 能促进生长激素释放，且具有抑制炎症因子释放、降低血压、增进食欲、促进细胞增殖、调节糖代谢等作用。本研究观察了120例类风湿关节炎(RA)患者血浆Ghrelin水平并分析了其基因C408A(Leu72Met)多态性，旨在探讨Ghrelin在RA发病中的作用。

1 资料与方法

1.1 临床资料 收集2010年1月～2010年12月河北省人民医院、河北医科大学第三医院、石家庄市第一医院RA患者120例(RA组)，男46例，女74例;年龄27～79岁，均为汉族。均符合1987年美国风湿病协会和2009年ACR/EULAR制定的RA诊断标准，病程为1～28 a，RA疾病活动性评分系统(DAS28)评分为(3.7±1.14)分;均无其他自身免疫性疾病及传染病。选择健康体检者150例为对照组，男64例，女85例;年龄21～70岁，均为汉族。两组年龄、性别具有可比性。研究对象均签署知情同意书，并经石家庄市第一医院伦理委员会同意。

1.2 血浆Ghrelin检测 两组均抽取空腹静脉血5 mL，其中2 mL采用ELISA法测定血浆Ghrelin水平，检测试剂盒由上海兰基生物有限公司提供，检测方法严格按照试剂说明书操作;余3 mL以树脂法提取DNA，保存于-70℃冰箱用于下述实验。

1.3 Ghrelin基因C408A位点多态性检测 采用聚合酶链反应—限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)法。查阅相关文献及与GenBank核对序列设计引物，上游引物序列5'-GCTGGGCTCCTACCTGAGC-3'，下游引物序列5'-GGACCCTGTTCACTGCCAC-3'(北京赛百盛基因技术有限公司合成)。以50 ng/μL的 DNA为模板进行 PCR扩增。反应条件:预变性94℃ 5 min，变性94℃ 45 s，退火61℃45 s，延伸72℃ 45 s，循环30次;末端延伸72℃ 5 min。PCR产物经2%琼脂糖凝胶确认后，继以BsrI限制性内切酶(Fermentas公司)酶切，65℃水浴保温4 h，于2%琼脂糖凝胶上100 V/cm电泳30 min，紫外灯下观测基因型。利用凝胶成像系统记录电泳结果、观测基因型。

1.4 统计学方法 采用SPSS13.0软件进行统计分析。计算Hardy Weinberg平衡以判断样本的代表性。计量资料以±s表示，组间比较用SNK检验及单因素方差分析(One-way ANOVA)。构成比的比较用χ2检验。P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 血浆Ghrelin水平 RA组和对照组血浆Ghrelin 分别为(115.03 ±38.12)、(156.28 ±65.84)pg/mL，组间比较，P ＜0.05(F=27.531)。

2.2 Ghrelin基因型和等位基因频率分布 两组Ghrelin基因型和等位基因频率分布均符合Hardy-Weinberg平衡(P＞0.05)，具有群体代表性。Ghrelin基因C408A存在碱基二态性C或A，对照组基因型为 AA 型1.4%、CA 型 27.3%、CC 型 71.3%，等位基因的频率分布A为15.0%、C为85.0%，携带突变基因CA+AA的频率为28.7%;RA组为AA型2.5%、CA 型 38.3%、CC 型 59.2%，基因频数分布A为21.7%、C为78.3%，携带突变基因 CA+AA的频率为40.8%。两组基因型和等位基因频率比较均有显著差异，P 均 ＜0.05(χ2=6.317)。

2.3 RA组Ghrelin基因型与血浆Ghrelin水平、病程、DAS28评分的关系 基因型为CC、CA、AA者血浆 Ghrelin 分别为(167.42 ±53.7)、(124.66 ±47.3)、(93.41 ± 11.5)pg/mL，三者比较，P ＜ 0.05(F=26.414);平均病程分别为 1.7、5.8、5.2 a，三者比较，P ＜0.05(F=28.983);DAS28 评分分别为(3.48 ±1.21)、(3.95 ±1.16)、(3.82 ±1.03)分，三者比较，P ＞0.05(F=4.921)。

3 讨论

RA是一种慢性全身性炎症，其发病病因与机制尚未完全清楚，主要临床表现为多滑膜关节炎和关节外病变，呈慢性、对称性病变。RA属于自身免疫炎性疾病，免疫复合物和类风湿因子是造成关节发生病变的重要因素之一。目前认为RA是环境因素与遗传因素共同作用的结果，而且很多炎症因子如IL-17、肿瘤坏死因子(TNF)、IL-6及血管内皮生生长因子等在发病中起重要作用［3，4］。Ghrelin能促进免疫细胞增殖、抑制炎性反应因子释放，在炎性反应中扮演重要角色;还能抑制T细胞，使细胞被炎性反应激活、mRNA 表达明显升高［4］;抑制 TNF-χ诱导的单核细胞趋化蛋白(MCP-1)mRNA 表述［5，6］。Ghrelin的单核苷酸基因多态性与血浆Ghrelin水平的关系存在争议，但前者可影响外周血液细胞中Ghrelin基因的mRNA表达，说明在免疫微环境的影响下Ghrelin很可能存在一个自分泌调节系统。三硝基苯磺酸诱导的结肠炎急性期小鼠Ghrelin及其受体mRNA表达明显增高［7］，在抗中性粒细胞胞质抗体(ANCA)相关的血管炎、炎症性直肠炎等急性炎症期 Ghrelin 的 mRNA 表达亦增加［8，9］。本研究显示，RA组血浆Ghrelin水平显著低于对照组。提示Ghrelin可能参与了RA的发生、发展。

文献［10］报道，甘肃地区回族人群 CC、CA、AA基因型比例分别为 70.8%、26.5%、2.7%。本研究进行的Ghrelin基因C408A多态性检测显示，两组共发现87例杂合子、5例纯合子、178例野生型，且组间基因型和基因频率比较均有显著差异。提示河北地区人群存在该位点变异，但基因型分布与上述文献报道无显著差异;CA型与纯合AA型均可增加RA发病风险。可能机制为基因多态性由突变遗传所致，但河北地区与甘肃地域相距较近。有研究［11］显示，Ghrelin基因Arg51Gln位点多态性者血浆Ghrelin水平较低，而C408A位点多态性者血浆Ghrelin水平较高。亦有研究证实，C408A和Gln90Leu两种Ghrelin多态性基因并不影响血浆Ghrelin水平［12］。本研究显示，RA组不同基因型者血浆Ghrelin水平及病程存在统计学差异。说明Ghrelin基因C408A多态性可能影响RA患者血浆Ghrelin水平及RA发病风险，其中CA型和AA型可能与，RA病程延长有关。推测各研究结果不同的原因很可能是血浆Ghrelin水平主要与营养状况有关。有研究［13］表明 Ghrelin基因A-501C多态性可增加RA的患病风险，但是并不会对RA的病情严重程度产生影响。本研究显示RA组不同基因型者DAS28评分差异无统计学意义，与上述文献一致。提示Ghrelin基因C408A多态性引起的Ghrelin血浆水平降低、发病提前及病程延长很可能与影响Ghrelin的正常功能及Ghrelin的mRNA表达，进而导致Ghrelin抗炎作用降低、RA相关致病炎性因子对机体产生相应破坏有关。

综上所述，RA患者存在血浆Ghrelin水平降低及Ghrelin基因C408A位点变异，纯合的AA型和杂合的CA型均可比野生的CC型增加RA患病风险增加，但Ghrelin基因可能并非河北汉族RA的主效基因。

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