细胞凋亡在激素性股骨头坏死中的研究进展*

刘玉 赵建民*王雪梅 刘瑞 李强

综述与讲座

细胞凋亡在激素性股骨头坏死中的研究进展*

刘玉 赵建民*王雪梅 刘瑞 李强

概述

糖皮质激素诱导的股骨头坏死（Steroid-induced femoral head necrosis,SIFHN）又称糖皮质激素诱导的股骨头缺血性坏死或股骨头无菌性坏死，激素导致股骨头坏死早在20世纪50年代就已经确立。据推测[1]，目前中国股骨头坏死患者有500～750万，每年新增病例约7.5～15万，激素成为我国股骨头坏死发病的首要原因。激素诱导的股骨头坏死严重影响患者的生活质量和劳动能力，给社会带来了巨大的负担，大部分患者最终不得不接受人工关节置换。如能早期诊断和积极治疗后可防止股骨头塌陷，保护关节功能，控制和延缓病情发展，可显著减少致残率[2,3]。因而激素性股骨头坏死发病机制的研究成为近年来国内外学者的研究热点，但目前仍没有完全阐明激素性股骨头坏死的发病机制。

过去对糖皮质激素诱导的股骨头坏死的发病机制有多种学说[4]，主要包括：骨内压增高学说；骨的灌注下降学说；脂肪栓塞学说；高凝状态学说等。近年来越来越多国内外研究表明糖皮质激素诱导股骨头坏死与骨细胞凋亡密切相关，Hwang Y等[5]通过激素诱导的兔股骨头坏死动物模型发现细胞凋亡确实存在于早期激素性股骨头坏死中，这为治疗早期激素性股骨头坏死寻找新的方法，并为在基因水平上治疗股骨头坏死打下基础。

细胞凋亡（Apoptosis）又称程序性细胞死亡（Programmed cell death,PCD）是细胞在一定生理或病理条件下，遵循自身程序结束生命的过程，最后细胞脱落、离体或裂解为若干凋亡小体，被其他细胞吞噬。细胞凋亡在个体发育和维持内环境的稳定中起着必不可少的作用[6]。细胞凋亡是多基因严格控制的一个主动过程有复杂的分子生物学机制涉及到一系列的基因激活表达以及调控等[7]。该过程主要包括以下几个阶段：凋亡的激发、细胞内凋亡信号传导及调控、凋亡效应分子激活、蛋白及DNA分子断裂、细胞死亡。细胞凋亡包括两条核心途径：外源性途径和内源性途径。

骨细胞是一种生命周期较长的细胞。骨细胞埋藏在骨基质的陷窝中，相邻的骨细胞彼此联系，其特征是胞浆突起通过骨小管伸展到骨基质中，并通过临近骨表面骨细胞的胞浆突起及骨小管，使骨细胞与骨表面细胞相联系。因此骨细胞通过细胞突起及其间的缝隙连接形成一个广泛的细胞通讯网络，通过感应骨组织的微小损伤和机械应力来完成修复反应，包括代偿性的骨增加或减少。另外通过破骨细胞吸收老化或损伤的细胞，并为成骨细胞产生新骨留下一定的空间。正常骨通过以上两套系统完成其正常的功能，力学信号的感受、分子信息的传递及骨的修复重建，一般不会看到骨细胞凋亡。

1 激素导致骨细胞凋亡

激素可导致股骨头坏死早已确立，很多学者对其进行了研究，报道常用的激素包括甲泼尼龙琥珀酸钠（简称甲强龙）、醋酸泼尼松龙注射液（简称泼尼松）。给药途径均为臀肌注射，用量不等，常见用量为20mg/kg或7.5mg/kg，2次/周。骨坏死的后期由于股骨头血管功能不良从而导致了骨细胞发生凋亡。其中Youm Y S等研究发现[8]使用大剂量糖皮质激素诱导的骨细胞和成骨细胞凋亡增加，由于凋亡的骨细胞和成骨细胞减少了骨的积累，影响骨的重建和修复，大量凋亡细胞的聚集和骨局部不可修复的缺损将破坏骨细胞间信息和能量的传递网络，使骨细胞的应力敏感性下降，导致骨小梁在负重区断裂，最后导致微骨折和股骨头的塌陷。Kerachian等[9]研究发现，细胞凋亡在骨组织累积导致股骨头发生坏死、塌陷，随着骨细胞凋亡的不断蓄积，在发生骨质疏松之前就可导致骨坏死的发生。Weinstein等[10]在激素性股骨头坏死软骨下半月征区域发现丰富的凋亡骨细胞，同时还发现在激素性股骨头坏死早期，并没有发生以坏死为特征的细胞肿胀及炎性反应。细胞的凋亡可能是骨组织细胞死亡的机制之一。同样Eberhardt等[11]指出大剂量激素可引起骨细胞的活性改变，凋亡是激素性骨坏死的首要变化。当骨细胞凋亡广泛发生时，虽然供应股骨头的血管尚无明显变化，但是骨坏死已经发生。Rojas[12]对患者在器官移植激素治疗前后进行了骨组织活检，发现在使用激素前无成骨细胞的凋亡，在使用激素后有大量成骨细胞凋亡。不仅正常成骨细胞由于使用激素而明显减少，且未凋亡的骨细胞大多数由有活性状态转入无活性状态，血磷的水平也随之下降，并随着激素剂量增加变化更加明显。

2 骨细胞凋亡相关因子及基因

众多学者通过激素诱导的股骨头坏死动物模型，研究发现细胞凋亡确实存在于激素性股骨头坏死中，这为治疗激素性股骨头坏死寻找新的方法，并为在基因水平上治疗股骨头坏死打下基础。细胞凋亡是受基因调控的精确过程，通过内源性和外源性两条途径发挥作用。

2.1 Fas及FasL

Fas及其配体FasL是近年来研究得最为深入的有关细胞凋亡的膜表面分子，Fas属于肿瘤坏死因子受体Ⅰ型跨膜蛋白分子，在许多细胞膜上有表达。作为细胞膜表面的受体蛋白，它含有与细胞凋亡信号传递密切相关的区域（死亡结构区域）。Fas配体（FasL）是Ⅱ型膜蛋白，属肿瘤坏死家族成员，主要在活化T细胞膜上表达。Kogianni等[13]研究发现，激素诱导的骨细胞凋亡与Fas/FasL凋亡途径有关。

2.2 Caspase家族

Caspase全称为含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶，每Caspase都富含半胱氨酸，它们被激活后，能够在靶蛋白的特异天冬氨酸残基部位进行切割，从而使细胞不可逆地走向凋亡。Caspase家族是细胞凋亡的重要执行者，Liu等[14]发现，Caspase-3的活性在细胞凋亡过程中显著升高，这说明激素诱导成骨样细胞凋亡是依赖Caspase-3的。梁博伟等[15]发现激素股骨头坏死模型中骨细胞膜联蛋白A1的表达下调，而膜联蛋白A1表达下调可激活Caspase3进而引起细胞凋亡。

2.3 Bcl-2家族

Bcl-2是细胞凋亡相关基因中研究最多的家族，抑制凋亡的基因有Bcl-2、Bcl-XL等，促进凋亡的基因有Bax、Bad、Bak等。许多学者发现，Bcl-2基因与激素有关，Bcl-2蛋白通过阻断细胞凋亡信号传递系统的最后共同通道而抑制细胞凋亡，从而促进细胞成活，成为重要的细胞生成基因。MoriishiT等[16]在特定的成骨细胞Bcl-2转基因小鼠研究发现性类固醇激素缺乏和糖皮质激素过多，可以造成骨细胞凋亡。

2.4 p53基因

P53基因是一种抑癌基因，其生物学功能是在G1和G2/ M期监视DNA的完整性。如有损伤，则抑制细胞增殖，直至DNA修复完成，如果DNA不能被修复，则诱导其凋亡。而且p53基因可通过上调C-myc、ICE、Fas抗原、bax基因，下调bcl-2基因，升高细胞内Ca2+浓度，诱发细胞凋亡。Ookawa等[17]研究发现p53的表达可导致大量细胞停滞在细胞分化周期的G0、G1和G2阶段，由此表明p53基因的表达可诱导成骨细胞凋亡。

还有一些其他的相关基因与因子，例如：O′Brien等[18]在鼠的基因中插入能使激素失活的基因来研究激素对骨细胞凋亡的潜在作用时发现，激素能够直接作用于成骨细胞和骨细胞，并刺激其凋亡，但是破骨细胞未受影响，从而使骨量减少。此外，Moraes等[19]研究发现激素能与骨细胞、成骨细胞及破骨细胞表面的受体结合，引起构象变化，影响核内某些基因的转录及表达。同时其他研究者发现11-HSD2转基因的小鼠就能有效减少激素引起的骨细胞凋亡。还有学者表明，糖皮质激素通过激活糖原合酶激酶3（GSK3）诱导成骨细胞凋亡，而应用GSK3抑制剂LiCl后，成骨细胞凋亡减少[20]。

3 骨细胞凋亡的实验室常见检测方法

骨细胞凋亡的生理生化过程十分复杂，细胞凋亡检测对于基础研究和临床诊断具有重要意义。目前用于体外细胞凋亡检测的方法很多，但每种方法都有自身的局限性。骨细胞不同于软组织细胞或者体外培养细胞，对其的检测有一定特殊性。例如，流式细胞术检测骨细胞凋亡较为困难，国内尚无用此方法检测的报道。进行细胞凋亡检测时，可以选择合适的方法或多种方法同时进行检测。

3.1 形态学观察

形态学观察是常用的一种通过对样本进行各种染色，应用光学或电子显微镜直观的对凋亡细胞进行观察。但只能定性，不能定量。

3.1.1 光学显微镜检测

细胞涂片或组织切片经固定染色后，就可用光学显微镜进行观察。通常用的染色方法有苏木精-伊红染色法、甲基绿-派若宁染色法、Giemsa染色法等。苏木精-伊红染色后，细胞质呈淡红色，细胞核呈蓝黑色，凋亡细胞的细胞核浓缩、染色致密。但需要鉴别的坏死组织呈均质红染，且结构分不清。甲基绿-派若宁染色后，凋亡细胞细胞核呈绿色，胞质呈红紫色。Giemsa染色后有凋亡小体产生。但由于凋亡细胞大多发生超微结构的形态学改变，而普通光学显微镜只能观察到胞膜起泡现象和凋亡小体，故利用光镜常常不令人满意。

3.1.2 电子显微镜检测

可以观察到细胞结构在凋亡不同时期的变化，因此电镜下观察凋亡细胞的超微结构改变，被认为是鉴定细胞凋亡的金标准[21]。早期可观察到细胞核染色体发生边聚，电子密度增强，核形不规整；胞质浓缩，细胞体积变小。晚期可看见膜内包裹有完整细胞器和细胞核碎片的凋亡小体。但电镜检测只能定性，不能定量，且对设备和检测人员的水平要求较高，费用昂贵样品制作过程复杂。

3.2 原位末端转移酶标记法（TUNEL法）检测

TUNEL法[22,23]是利用末端转移酶TdT将标记的脱氧核苷酸转移到DNA缺口或3＇羟基末端上，常使用的核苷酸为dUTP，标记物为荧光素、地戈辛生物素等。TUNEL法不仅可以对凋亡细胞进行量化，而且可以动态观察凋亡细胞超微结构的变化以及分析细胞表型。但是它的局限性为只能标记中期与晚期的凋亡细胞，而不能检测只发生DNA大片段断裂的凋亡细胞。染色体DNA断裂后会产生大量的黏性3＇-OH末端，生物素标记的Dutp、过氧化物酶、碱性磷酸酶形成的衍生物在脱氧核糖核苷酸末端转移酶的作用下可与黏性末端结合，进行原位凋亡细胞的检测[24-26]。正常细胞中为完整的双链结构，无黏性末端的形成，故无阳性表现但由于坏死细胞中断裂也可产生黏性末端，故可能出现假阳性结果，需要结合其它实验方法加以排除。

3.3 酶联免疫吸附法（ELISA法）检测

ELISA法是定量检测细胞凋亡的免疫化学方法。在细胞凋亡时由于Ca-Mg依赖性核酸内切酶进入核小体内，将双链DNA从各核小体间连接处裂开，形成180～200bp或其整数倍的寡核苷酸片段。核小体内的DNA与组蛋白形成紧密复合物，不被核酸酶裂解。将核小体上清液加入吸附有组蛋白抗体的微孔板，核小体组蛋白与抗组蛋白抗体结合。当加入过氧化物酶标记的DNA抗体后，DNA片段对过氧化物酶底物产生显色反应。ELISA可用于贴壁培养细胞、悬浮培养细胞、血清、血浆等的检测[27]。该方法可检测早期细胞凋亡，灵敏度高，适用于多样本。

3.4 线粒体膜电位的检测

线粒体在凋亡中起关键作用，是一种电化学方法。线粒体膜电位是线粒体在尚未发生明显的形态变化时，其膜电位已经发生了变化。线粒体内膜两侧电子分布不对称导致线粒体膜电位不平衡而形成电化学梯度，线粒体膜孔道大小的改变会导致线粒体膜电位的改变，从而调节细胞凋亡。线粒体膜电位在细胞凋亡早期已经发生改变，而此时线粒体形态尚未出现明显变化，所以线粒体膜电位的下降被认为是细胞凋亡级联反应过程中最早发生的事件[28]。

4 展望

细胞凋亡在股骨头坏死发病过程中占有重要地位，是目前生命科学界热门话题之一。细胞凋亡是受细胞内源性基因、酶和信号传导途径调控的过程。鉴于骨细胞凋亡在股骨头发生、发展机制中的重要地位，通过阻断、干预凋亡进行治疗的策略逐步得到广泛的接受。近年来，国内外均已开展了多项抗凋亡治疗的研究，主要针对细胞凋亡的诱发因素、激活通路和凋亡调控基因等。降脂[29]可使抗凋亡基因bcl-2和bcl-XL上调，从而达到抑制细胞凋亡[30]，使我们在治疗激素性股骨头坏死上更进一步。

[1] 陈演.股骨头坏死病因学研究的某些进展[J].华西医学，2009，24（7）:1899-1901.

[2] Weinstein R S.Glucocorticoid-induced osteonecrosis[J].Endocrine,2012,41（2）:183-190.

[3] Chan K L,Mok C C.Glucocorticoid-induced avascular bone necrosis:Diagnosis and management[J].The open orthopaedics journal,2011,6:449-457.

[4] Drescher W,Schlieper G,Floege J,et al.Steroid-related osteonecrosis-an update[J].Nephrology Dialysis Transplantation,2011, 26（9）:2728-2731.

[5] Hwang Y,Park J,Choi S H,et al.Traumatic and Non-traumatic Osteonecrosis in the Femoral Head of a Rabbit Model[J].Laboratory animal research,2011,27（2）:127-131.

[6] Kale J,Liu Q,Leber B,et al.Shedding light on apoptosis at subcellular membranes[J].Cell,2012,151（6）:1179-1184.

[7] Ouyang L,Shi Z,Zhao S,et al.Programmed cell death pathways in cancer:a review of apoptosis,autophagy and programmed necrosis[J].Cell proliferation,2012,45（6）:487-498.

[8] Youm Y S,Lee S Y,Lee S H.Apoptosis in the osteonecrosis of the femoral head[J].Clinics in orthopedic surgery,2010,2（4）: 250-255.

[9] Kerachian M A,Harvey E J,Cournoyer D,et al.A rat model of early stage osteonecrosis induced by glucocorticoids[J].J Orthop Surg Res,2011,6:62.

[10]Weinstein R S,Nicholas R W,Manolagas S C.Apoptosis of Osteocytes in Glucocorticoid-Induced Osteonecrosis of the Hip 1[J]. Journal of Clinical Endocrinology&Metabolism,2000,85（8）: 2907-2912.

[11]Eberhardt A W,Yeager-Jones A,Blair H C.Regional Trabecular Bone Matrix Degeneration and Osteocyte Death in Femora of Glucocorticoid-Treated Rabbits 1[J].Endocrinology,2001,142（3）: 1333-1340.

[12]Rojas E,Carlini R G,Clesca P,et al.The pathogenesis of osteodystrophy after renal transplantation as detected by early alterations in bone remodeling[J].Kidney international,2003,63（5）: 1915-1923.

[13]Kogianni G,Mann V,Ebetino F,et al.Fas/CD95 is associated with glucocorticoid-induced osteocyte apoptosis[J].Life sciences,2004 ,75（24）:2879-2895.

[14]Liu Y,Porta A,Peng X,et al.Prevention of Glucocorticoid-Induced Apoptosis in Osteocytes and Osteoblasts by Calbindin-D28k [J].Journal of Bone and Mineral Research,2004,19（3）:479-490.

[15]梁博伟.沉默膜联蛋白A1对兔骨髓间充质干细胞和成骨细胞生物特性的影响[D].广西医科大学，2012.

[16]Moriishi T,Maruyama Z,Fukuyama R,et al.Overexpression of Bcl2 in osteoblasts inhibits osteoblast differentiation and induces osteocyte apoptosis[J].PloS one,2011,6（11）:27487.

[17]Ookawa K,Tsuchida S,Adachi J,et al.Differentiation induced by RB expression and apoptosis induced by p53 expression in an osteosarcoma cell line[J].Oncogene,1997,14（12）:1389-1396.

[18]O'Brien C A,Jia D,Plotkin L I,et al.Glucocorticoids act directly on osteoblasts and osteocytes to induce their apoptosis and reducebone formation and strength[J].Endocrinology,2004,145（4）: 1835-1841.

[19]Moraes LA,Paul-Clark MJ,Rickman A,et al.Ligand-specific glucocorticoid receptor activation in human platelets. [J].Blood. 2005,106:4167-4175.

[20]Yun S I,Yoon H Y,Jeong S Y,et al.Glucocorticoid induces apoptosis of osteoblast cells through the activation of glycogen synthase kinase 3[J].Journal of bone and mineral metabolism,2009,27（2）:140-148.

[21]COMPTON M M,CIDLOWSKI J A.Rapid in Vivo Effects of Glucocorticoids on the Integrity of Rat Lymphocyte Genomic Deoxyribonucleic Acid[J].Endocrinology,1986,118（1）:38-45.

[22]LooDT.In situ detection of apoptosis by the TUNEL assay[J].Methods Mol Biol,2013,935:207-13.

[23]Doonan F,Cotter T G.Detection of DNA fragmentation in retinal apoptosis by TUNEL[M].Retinal Degeneration.Humana Press, 2013:207-213.

[24]Kyrylkova K,Kyryachenko S,Leid M,et al.Detection of apoptosis by TUNEL assay[M].Odontogenesis.Humana Press,2012: 41-47.

[25]Loo D T.In situ detection of apoptosis by the TUNEL assay:an overview of techniques[M].DNA Damage Detection In Situ,Ex Vivo,and In Vivo.Humana Press,2011:3-13.

[26]Hewitson T D,Darby I A.In situ localization of apoptosis using TUNEL[M].Histology Protocols.Humana Press,2010:161-170.

[27]Huerta S,Goulet E J,Huerta-Yepez S,et al.Screening and detection of apoptosis[J].Journal of surgical Research,2007,139（1）: 143-156.

[28]Lolá S,Morgado AL,Rodrigues CM.Death receptors and mitochondria[J].Biochim biophys Acta,2013,1830（1）:2160-6.

[29]Zhang P,Liang Y,Kim H,et al.Evaluation of a pig femoral head osteonecrosis model[J].J Orthop Surg Res,2010,5:15-21.

[30]Cui Q,Botchwey E A.Emerging ideas:treatment of precollapse osteonecrosis using stem cells and growth factors[J].Clinical Orthopaedics and Related Research ,2011,469（9）:2665-2669.

10.3969/j.issn.1672-5972.2014.04.012

swgk2014-05-0100

刘玉（1986-）男，硕士，在读研究生，医师，工作方向：骨外科。

*[通讯作者]赵建民（1965-）男，教授，硕士研究生导师，主任医师。工作方向：骨外科。

2014-05-20）

国家自然科学基金资助项目（81360224）

内蒙古医科大学附属医院，内蒙古呼和浩特010030