非小细胞肺癌中RAD51、ERCC2和BAG-1基因多态性与临床病理特征的关系

陆俊国，李 桃，丁令池，陈 希，刘继斌

(江苏省南通市肿瘤医院 肿瘤内科，江苏 南通，226001)

肺癌是人类最常见的恶性肿瘤之一，其恶性程度高，目前发病率在中国逐年升高，非小细胞肺癌(NSCLC)在肺癌中占70%～80%。流行病学及病因学研究[1]证实，肺癌发生是遗传易感和环境因素共同作用的结果。单核苷酸多态(SNP)是最常见的遗传多态，它组成了个体不同的遗传背景。本研究探讨NSCLC中ERCC2/XPD Lys751Gln，RAD51 codon 135以及 BAG-1codon 324 SNP的表达与临床病理特征的关系，现报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2008—2011年本院收治非小细胞肺癌患者100例，男59例，女41例，年龄31～76岁，平均59岁。另选取正常人80例作为对照组。南通市肿瘤医院住院的初治晚期NSCLC患者均经病理学确诊，无年龄、性别差异。病例组平均年龄(57.15±10.23)岁，对照组平均年龄(54.46±10.15)岁。病例组和对照组的年龄、性别、吸烟、饮酒情况比较，差异无统计学意义(P<0.05)。研究对象均签署书面知情同意书，完成流行病学调查并自愿提供一份5 mL的外周血样，所有标本取材以及研究方案均获得本院伦理委员会的批准。

1.2 DNA提取和基因多态性的检测

在告知患者的前提下，所有受试者空腹抽取静脉血5 mL，置-20 ℃冷冻备用。基因组DNA的提取采用传统的酚-氯仿抽提法，以聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)方法对RAD51 codon 135、ERCC2/XPDLys751Gln和BAG-1 codon 324多态性进行检测。ERCC2/XPD基因的引物为5′-CTTCATAAGACCTTCTAGCACCAC-3′和5′-TACGGACATCTCCAAATTCATTC-3; BAG-1codon 324的引物为，5′-CAGGTAGTGTAGGAGCGTGGTG-3′和5′-CACCCAGAGGTCCAAACAGC-3′; RAD51 codon 135引物为5′-CACCTAACTGGCATCTTCACTT-3′和5′-ACAGGATAAGGAGCAGGGTT-3′。PCR反应体系: 20 μL中含50 ng基因组DNA，12.5 pmol/μL各引物，0.1 mmol/L各单核苷酸，1.8 mmol/L MgCl2，1.0 U Taq酶，1×PCR反应缓冲液。PCR反应条件：预变性5 min; 95 ℃ 30 s、退火45 s、72 ℃ 60 s，共40个循环; 72 ℃，延伸6 min。PCR产物均用内切酶PstⅠ 37 ℃温育，在3.0%琼脂糖凝胶80 v电泳上100 min检测电泳、溴化乙啶染色分析酶切产物以此确定各基因型。本研究由2人使用盲法对基因型分别进行判读，对判读不一致的样本进行基因型的重新检测。随机抽取10%样本，使用双盲法重复检测验证，结果一致。

1.3 统计学检测

采用SAS 9.1.3统计软件，分别统计3种基因型的分布频率，同时使用χ2检验确认其是否符合Hardy-Weinberg平衡。本研究使用的统计方法包括χ2检验，计量资料的t检验和方差分析，比值比(OR)计算风险比例及其95%可信区间(CI); 同时使用Logistic回归分析分析各基因型与环境危险因素之间的交互作用。

2 结 果

2.1 NSCLC患者BAG-1 codon 324、RAD51codon 135、ERCC2/XPD Lys751Gln基因型分布

BAG-1 codon 324、RAD51 codon 135、ERCC2/XPD Lys751Gln基因型频率均符合Hardy-Weinberg 平衡(P=0.41，P=0.56，P=0.51)。100例NSCLC 患者中，经测序以及PCR-RELP分析结果显示，BAG-1 codon 324存在3 种等位基因型。基因型的分布频率分别为C/C型占81%(81/100)、C/T型占19%(19/100)以及T/T型占0%(0例); ERCC2/XPD 751基因型的分布频率分别为C/C 型69例(69%)、C/A基因26例(30%)和A/A基因型5例(5%); RAD51 codon 135基因型的分布频率分别G/G型占67%(67/100)、G/C型33%(33/100)、未现C/C型。与野生基因型C/C型相比,携带ERCC2/XPD C/A基因型和A/A基因型者患NSCLC的OR分别是1.42(95% CI: 1.11～2.64)和1.25( 95% CI: 0.33～4.35)，经年龄、吸烟、饮酒、饮茶和家族史等调整后OR分别是1.53(95% CI: 1.15～3.32)和0.58(95% CI: 0.15～2.39)。

与野生基因型C/C型相比，携带BAG-1C/T基因型者患NSCLC的OR是1.37(95% CI: 1.22～2.84)，经年龄、吸烟、饮酒、饮茶和家族史等调整后OR是1.28(95% CI: 1.08～2.74); 与野生基因型G/G型相比，RAD51 G/C基因型者患NSCLC的OR分别是1.33(95% CI: 1.19～2.92)，经年龄、吸烟、饮酒、饮茶和家族史等调整后OR是1.03(95% CI: 1.06～2.29)。

2.2 RAD51、ERCC2和BAG-1基因多态性和NSCLC临床病理特征的关联分析

经年龄、吸烟、饮酒和家族史等调整后，ERCC2/XPD C/C基因型多态性与肿瘤大小、包膜有无、肿瘤多发、分化程度、Edmondson-Steiner分期、TNM分期、淋巴结转移状态、远处转移的几率均无显著相关性(P>0.05); ERCC2/XPD C/A基因型和A/A基因型多态性与肿瘤大小、包膜有无、肿瘤多发、分化程度、Edmondson-Steiner分期、TNM分期亦无显著相关性(P>0.05)，但与淋巴结转移状态有显著相关性(P=0.038，OR=2.26，95% CI: 1.69～3.59); 与远处转移几率的相关性更显著(P=0.005，OR=2.47，95%CI: 1.38～4.24)。

BAG-1 codon 324 C/T型，RAD51 codon 135 G/C型基因多态性与肿瘤大小、包膜有无、肿瘤多发、分化程度、Edmondson-Steiner分期、TNM分期亦均无显著相关性(P>0.05)，但与淋巴结转移状态有显著相关性(P=0.042，OR=2.57，95% CI: 1.62～4.44;P=0.049，OR=2.86，95% CI: 1.39～3.62)。

3 讨 论

中国肺癌的发病率和死亡率逐年升高，位居城市人口中恶性肿瘤之首[2]，非小细胞肺癌(NSCLC)约占肺癌总数的85%,并且初治时约70%是晚期患者。目前导致肺癌发生的确切病因还没有找到，但环境污染是导致肺癌的重要致病因素之一，其中吸烟是最重要的危险因素[3]。有研究[4-5]发现同一地区暴露于相同致病环境中，只有少部分人患病，由此得出基因多态性等遗传因素在肺癌发生的过程中起到重要作用。

ERCC2又称着色性干皮病基因D (XPD)，ERCC2/XPD的作用是通过核苷酸切除修复(NER)途径去除各种因素导致的DNA损伤[6]。目前对XPD 的检测缺乏大样本，结果也争议较大。袁凡等[7]对中国151例晚期NSCLC 患者进行的研究结果表明，XPD Lys751Gln基因多态性与肺癌的发生发展没有相关性，与患者的病理类型、淋巴结转移、临床肿瘤分期等临床病理特征都无相关性。Liang等[8]研究表明，ERCC2/XPD 751Lys/Gln多态性是中国肺癌发生的危险因素之一，携带变异型等位基因751Gln的患者发生肺癌的风险是751Lys/Lys纯合子的2倍，这与本研究结果一致。BAG-1作为一种抗凋亡基因，通过与多种靶蛋白结合从而抑制细胞凋亡，有研究[9]表明BAG-1可能在恶性肿瘤的发生发展以及侵袭转移过程中起作用。RAD51蛋白作为同源重组(HR)过程中的关键酶，使核酸蛋白在单链或双链DNA 复制期间完成同源配对和链交换反应[10]。在已经有的BAG-1 codon 324，RAD51 codon 135多态性和 NSCLC的关系探讨中，彭亚婷等[11]认为与携带RAD51变异基因型(G/C和C/C)的个体具有更高的患癌风险(P<0.05)，但与肺癌的病理学类型及组织学分级无相关性;陶雪勤等[12]研究发现与携带G/G的个体相比，携带Rad51G135C变异基因型(G/C和C/C)的个体具有更高的患癌风险(P<0.05)。

本次研究发现ERCC2/XPD与RAD51 codon 135 以及BAG-1 codon 324基因多态性与NSCLC发生关系密切，与野生基因型C/C型相比,携带ERCC2/XPD C/A基因型和A/A基因型者患NSCLC的OR分别是1.53(95% CI: 1.15～3.32) 和0.58(95% CI: 0.15～2.39); 与野生基因型C/C型相比，携带BAG-1C/T基因型者患NSCLC的OR是 1.28(95% CI: 1.08～2.74); 与野生基因型G/G型相比，RAD51 G/C基因型者患NSCLC的OR是1.03(95% CI: 1.06～2.29)，尽管ERCC2/XPD 与RAD51 codon 135以及BAG-1 codon 324基因多态型在NSCLC发生中的作用仍存争议，但本次研究发现ERCC2/XPD 与RAD51 codon 135以及BAG-1 codon 324基因多态性改变增加了NSCLC发生的风险，并在研究中发现ERCC2/XPD C/A基因型和A/A基因型多态性与BAG-1 codon 324 C/T型，RAD51 codon 135 G/C 型多态性与肿瘤大小、包膜有无、肿瘤多发、分化程度、Edmondson-Steiner分期、TNM分期等因素均无相关性(P>0.05)，但ERCC2/XPD C/A和A/A基因型多态性与淋巴结转移状态有相关性(P=0.038，OR=2.26，95% CI: 1.69～3.59); 与远处转移几率的相关性更显著(P=0.005，OR=2.47，95%CI: 1.38～4.24)。BAG-1 codon 324 C/T型，RAD51 codon 135 G/C型基因多态性与淋巴结转移状态有相关性(P=0.042，OR=2.57，95% CI: 1.62～4.44;P=0.049，OR=2.86，95% CI: 1.39～3.62)。

大量的研究认为与野生基因型C/C型相比，携带ERCC2/XPD C/A基因型和A/A基因型,可明显减少染色单体型畸变的修复能力[13]，这种染色体的损伤在合并吸烟的人群中更为常见[14]，说明正是携带变异型等位基因C/A基因型和A/A基因型的NSCLC患者降低了染色单体型变异的修复能力，从而使得增加了肿瘤的侵袭性以及远处转移的能力，并且这部分人中群中大多数患者合并吸烟。因而对于携带ERCC2/XPD C/A基因型和A/A基因型的NSCLC患者应该规劝戒烟，一方面提示作者在高危人群中应尽早提前干预，另一方面也提示作者ERCC2/XPD C/A基因型和A/A基因型多态性与BAG-1 codon 324 C/T型，RAD51 codon 135 G/C 型基因基因型可以预测NSCLC的侵袭性或转移行为。

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