肝癌和肝纤维化发生EMT及相关信号通路的分子机制

汤志杰 张茂娜综述 陈 莉审校

上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transitions，EMT)是由连接紧密、不能运动的上皮细胞向连接疏松、具有迁移活动的间质组织转化的过程[1]，即上皮细胞间的游离面-基底面极性和细胞间紧密连接、黏附连接的丧失，紧接着间质表型标志物呈现表达，细胞的播散特性和能动性获得增加，细胞向间质表型转化[2]。但EMT是可逆的，即间质上皮转化(mesenchymal-epithelial transition,MET)，MET对发生EMT的肿瘤细胞转移至新位点定居并长期增殖具有重要意义[3]。EMT有三型[4-6]：Ⅰ型EMT与着床、胚胎形成和器官发育有关；Ⅱ型EMT与组织损伤和炎症反应有关；Ⅲ型EMT发生与癌的侵袭转移密切相关，因其基因方面倾向于克隆生长和局部肿瘤的发展，癌细胞发生EMT后增强了向远处侵袭和扩散的能力，迁移到远处脏器后，癌细胞又通过MET在转移部位形成新的病灶[4]。目前大量文献[7-11]表明肝细胞恶性生长发展到肝癌，癌细胞从肝细胞肝癌脱落并获得迁移和侵袭能力时均发生了EMT。但是目前对EMT的相关信号通路及特异性标志物尚缺乏研究。本文综述近年来研究肝癌及相关病变中发生EMT的意义及相关信号通路的分子机制的进展，从分子水平理解EMT的发生与通路机制的作用，寻找肝癌发生及复发转移的预测标记和干预治疗靶点，为研究和治疗肝癌发生提供新的思路。

1 与肝癌发生EMT相关信号通路的分子调节机制

新近研究发现改变基因和微环境的许多信号通路可以调控肝癌中EMT。目前主要的研究通路有TGF-β通路、Wnt(wingless-type)/β-catenin通路、Hodgehog通路和一些调控因子对EMT的作用[7]。

1.1 TGF-β信号通路对EMT调控

EMT的发生受许多细胞因子及微环境的调控，其中TGF-β是调控生长和分化的重要结构的相关多肽因子家族之一，TGF-β在肝脏发育和癌症发生的过程中具有复杂矛盾多变的作用。在肝纤维化中，由TGF-β诱导肝细胞发生EMT，是成纤维细胞的1个潜在来源[12]。在体内，人肝癌细胞高表达TGF-β的mRNA和蛋白质，在转基因小鼠中，尿中TGF-β升高预示着肝硬化很低的生存率，TGF-β在肝中的并构表达加速了肝癌的发生。表明肝癌细胞能够抵抗TGF-β的抑癌作用[13]。TGF-β促进培养的大鼠肝上皮细胞的自发转化，加速了肝癌的发生。因此，肿瘤细胞可以应答TGF-β发生EMT。

TGF-β家族成员可以在许多生物系统中和病理情况下启动和维持EMT,尤其是通过重要信号通路的激活和广泛信号网络中整合的转录调控因子的激活[14]。在EMT中调控参与TGF-β信号通路的主要细胞因子有：Smad蛋白、Snail蛋白、组蛋白去乙酰化酶1(histone deacetylase-1,HDAC-1)、皮质肌动蛋白(cortactin)、骨形成蛋白7(bone morphogenesis protein-7,BMP-7)以及Hodgehog蛋白等[6]。TGF-β通路是目前公认的作用比较明确的诱导EMT的信号通路[15]。TGF-β调控下游信号通路主要通过经典途径(依赖Smads的通路)和非经典途径(不依赖Smads通路)。经典途径是通过TGF-β与细胞膜上的TGF-β受体结合后活化Smad2/3，再与Smad4结合，形成Smad2/3/4/复合物，发生核转位并进入细胞核[16]，调节各种转录因子通过Smad途径并由PI3K/Akt介导调控EMT的发生。TGF-β作为EMT重要的诱发因子，与胞外基质蛋白层黏连蛋白laminin，LN-5有协同作用，能诱导肝癌发生EMT使细胞具有浸润性，并发生转移。对人肝癌组织进行免疫组化分析，在肿瘤侵袭中可以观察到大量LN-5的表达，Snail和Slug表达上调，E-cadherin下调，β-catenin降解，肿瘤转移。

另外，TGF-β可调控不同类型细胞的生长、分化和凋亡。虽然在肝癌细胞中EMT的发生可以抵抗TGF-β诱导的细胞凋亡作用，但是，TGF-β促进癌细胞形态和表型改变导致EMT发生，其抗细胞凋亡的分子机制尚不完全清楚。有证据显示在控制TGF-β诱导的生长抑制和(或)凋亡的基因程序和调控EMT的基因程序之间有1个串扰，即细胞一旦接受了间质表型，便对TGF-β的抑制作用不发生应答[17]。然而逃避凋亡生存下来的这些细胞亚群则伴随着形态和表型的改变发生了EMT。TGF-β的自分泌环对肝细胞发生EMT后抵抗凋亡的作用是通过上调EGFR配体的表达来实现的[18]。这些实验充分说明EMT拮抗了癌细胞凋亡。总之，TGF-β对EMT的调控机制、发生EMT的细胞可以抵抗TGF-β诱导的凋亡机制需要进一步的研究。

1.2 Wnt/β-catenin信号通路对EMT调控

Wnt(wingless-type)/β-catenin信号通路是调控EMT发生的另一条重要通路。经典的Wnt/β-catenin信号传导通路包括：配体(Wnt家族分子)，跨膜受体[Frizzled家族分子Fz、低密度脂蛋白受体相关蛋白5/6(LDL receptor-related proteins 5 and 6，LRP5/6)]、胞浆调节蛋白(蓬乱蛋白Dishevelled，Dsh)、大肠腺瘤样息肉(adenomatous polyosis coli,APC)、体轴发育抑制因子(Axin)、糖原合成酶激酶-3β(Gsk-3β)、β-catenin以及核内转录因子[T细胞因子/淋巴增强因子(TCF/LE)F家族][19]。Wnt受体Fz的胞外区与Wnt结合，其胞内区作用于Dsh，而Dsh与其他蛋白一起阻断β-catenin的降解途径，致使β-catenin在胞质中积累。一方面，β-catenin介导E-Cadherin与α-catenin相结合而介导细胞间黏附；另一方面，当β-catenin积聚到一定程度后发生核转位，与TCF/LEF相互作用，激活细胞恶化的靶基因c-myc，细胞周期蛋白D1(cyclinD1)和下游靶基因如Snail、Slug的转录，进而诱导EMT的发生[7]。人们发现Wnt信号通路中的下游因子在HCC中高表达，超过10项研究发现HCC中伴有β-catenin突变，其他一些研究则发现与对照组相比，伴有β-catenin突变的癌前病变有更大的癌变风险[20]。

1.3 Hodgehog信号通路对EMT调控

正常成人组织中Hodgehog(Hh)信号通路的活性较低，但在恶性肿瘤的发生、发展、EMT的转化过程中被异常激活，且在低分化癌细胞中Hh信号通路活化更明显[7]。Hh信号通路主要由分泌型糖蛋白配体Hedgehog、跨膜蛋白受体Ptched(Ptch)，跨膜蛋白Smoothened(Smo)、核转录因子Gli蛋白及下游靶基因组成。Hh通过自分泌及旁分泌的形式刺激肿瘤细胞生存，促成新生血管形成、促进肿瘤细胞发生EMT，以及引导肿瘤向远处器官转移[21]。Hh、Smo、Gli作为激动因子发挥正调节作用，Ptch作为抑制因子发挥负调节作用。当缺乏启动因子Hh蛋白时，受体Ptch与信号转换器Smo结合并抑制Smo的活性，Gli作为转录效应器被剪切修饰，以非全长的形式起转录抑制功能。当Hh蛋白与Ptch结合时，Smo上的抑制效应被解除，激活下游的转录调节因子Gli蛋白，以全长形式转入核内引起靶基因SIP1(ZEB2)的转录，调控与EMT发生有关的下游分子Twist2和Snail2的表达[21-22]，导致细胞存活、增殖、发生EMT。Hh信号通路可通过激活TGF-β/Smads促进癌的浸润和转移，并上调基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)，尤其是MMP-2和MMP-9[23]；在低分化肝癌细胞中Gli1显著激活，Hh信号通路的激活可能与EMT的发生和化疗耐药有关。作为Hh通路的特异性阻断剂，如已被用于消除了小鼠髓母细胞瘤的HhAntag(Cur-691)[24]的小分子，环靶明(Cyclopamine)[7]等，用其阻断Hh信号，或用SiRNA沉默肝癌细胞中的Gli1，将抑制癌细胞增殖、促进凋亡(可能与Bcl-2的表达相关)，并抑制血管形成，癌细胞的EMT现象和迁移能力受限[25]，并消除HCC亚群的化疗耐药。这些研究需要体内实验的进一步证明。Hh信号通路可能为肿瘤的药物治疗提供另一个有效的靶点，值得更深入的研究。

1.4 HNF-4α/HNF-1α对EMT的调控

肝癌发生时，在肝分化过程中由肝富集转录因子：肝核因子4α(hepatocytes nuclear factor，HNF-4α)/HNF-1α伴侣的特定结合，控制着关键步骤。HNF-4α在肝细胞肝癌中的表达较邻近的无瘤组织中的表达低。过度表达HNF-4α能抑制肝细胞肝癌的生长，并诱导上皮标志物的表达，发生细胞表型转变，这与Spagnoli等在掌状细胞(palmate cell)中观察的特点一致。在这些细胞中激发肝细胞可获得稳定掌状表型的形态特点。HNF-4α和HNF-1α同时下调了对Snail转录的激活能力。Pelletier等研究也表明，HNF-1α不仅对肝细胞分化意义重大，还在肝细胞中维持上皮细胞表型起重要作用。HNF-1α抑制剂可触发人肝癌细胞株的EMT[9]。在沉默HNF-1α的肝癌细胞中，肝细胞和上皮细胞标志物E-cadherin、β-catenin、ZO-1、Claudins、CK18/19等的表达降低，而间充质的标志物Snail、Twist、vimentin、Ⅰ型胶原蛋白、TGF-β、ZEB1/2、Smad、NF-κB、ERK及P38等的表达上调[9，26]。Snail作为肝分化主导基因HNF-4α的转录抑制剂，沉默干细胞中HNF-4α后，上皮细胞重新分化。沉默肝细胞中HNF-4α后，干细胞源性特征重新获得[27]。因此推断Snail、HNF-4α是控制肝干细胞分化和维持的调控因子。另外，在抑制HNF-1α或伴有HNF-1α突变的肝细胞腺瘤中过度表达TGF-β，提示HNF-1α抑制可触发人肝癌细胞株EMT的TGF-β/smad通路的激活[9]。Valdes F等[28]分离了从TGF-β诱导的胎鼠肝细胞凋亡中逃生下来并且发生EMT的亚群：TGF-β处理胎鼠肝细胞(TGF-β treated fetal hepatocytes，TβT-FH)和血清处理的胎鼠肝细胞(serum treated fetal hepatocytes，ST-FH)均高表达vimentin和Snail，低表达CK-18和E-cadherin。并且这两种细胞缺乏分化标记，如肝富集转录因子HNF-4α或HNF-1α，但有趣的是祖细胞高表达OV-6(OV-6蛋白在肝祖细胞、卵原细胞以及不同的肝癌细胞株中表达，但在分化成熟肝细胞中未发现)，表现出肝祖细胞和一些肝癌细胞的特性。不同的实验方法已经表明，在细胞发展和癌变过程中，主要发生的事件是上皮特点的逐渐丢失和纺锤形细胞形态(EMT)的逐渐获得，为癌症的发生提供了便利。

1.5 microRNA对EMT的调控

肝癌发生浸润转移时，肝癌发生EMT，使细胞间连接丧失，形成细胞迁移的有利结构，癌细胞迁移能力逐渐增强。因此认为EMT是癌细胞离开有序组织结构的初始阶段，是细胞释放以致肝内传播或远处转移的先决条件[12]。在TGF-β诱导AML12小鼠肝细胞发生EMT时，Snail1表达升高，而miR-30家族成员表现出显著的下调。进一步分析表明，miR-30可通过直接靶向预测的Snail1mRNA 3’UTR的miR-30的保守序列的结合位点负调控Snail1的表达。更重要的是，用miR-30b转染AML12细胞后可显著抑制TGF-β诱导的EMT[29]。通过评估细胞形态改变和Snail1的表达谱以及E-cadherin和其他成纤维细胞标志物，证明TGF-β诱导EMT发生的肝细胞在转染miR-30b后显著抑制了肝细胞迁移，这些研究结果为理解miR-30调控EMT的作用提供了新的思路。在EMT发生时，Snail家族成员(Snail1和Snail2，即Snail和Slug表达升高)和ZEB家族成员(尤其是ZEB2)过表达[9]。p53上调miR-200和miR-192家族成员。miR-200家族成员抑制ZEB1/2的表达，miR-192家族成员抑制ZEB2的表达。因此抑制EMT的过程可由p53通过抑制转录因子ZEB1和ZEB2的表达来实现[30]。Lee等研究发现miR-122有较强的肿瘤抑制作用，在肝癌中其表达下降，上调miR-122的表达可逆转肝癌细胞的间质特性，从而降低癌细胞的浸润和转移[31]。因此推测，miR-122可作为肝癌EMT过程重要的调节器。细胞黏附的丢失和迁移能力的获得，还有浸润性这些特征在肿瘤进展的EMT中均发生，并在转录因子中，Snail1作为与抑制E-cad转录密切相关的基因，在小鼠皮肤肿瘤和人乳腺癌浸润前表达活性增强。Francisco Valde′ s认为在癌细胞中，EMT反映出介导细胞间识别和黏附并相互耦合以维持细胞形态和极性的机制丧失，因此，深刻理解在发生细胞分化过程中激发EMT的分子机制，可为浸润过程中的调控事件提供一个新的思路。

2 EMT在肝纤维化中的作用

最近研究发现在原发性胆汁肝硬化和非酒精性脂肪性肝硬化模型中，肝细胞和胆管上皮细胞可通过EMT过程转化为肌成纤维细胞，参与肝纤维化的发展[8]。越来越多的研究证明肝细胞发生EMT是体内肝纤维化的重要机制，这也逐渐成为目前研究的热点。EMT在肝纤维化中最明显的特征是在受损组织中上皮细胞获得运动表型[4]。假设这是肝细胞在恶劣生长微环境中的1个整合逃生程序，这个恶劣生长微环境由氧化还原改变所激发，也由改变了的细胞外基质(extracellular matrix，ECM)复合物的作用所引起，而且还与慢性伤口愈合反应时高浓度生长因子和细胞因子作用有关[4]。这个逃生程序的特点是通过细胞代谢和运动的改变，以达到促进细胞生存选择逃离氧化损伤的目的。逃生程序一般有2个可能的结果：运动的肝上皮细胞到达1个相对好的微环境，并发生向原始表型的重新分化；或者该细胞持续处在恶劣生长微环境中，其逃生表型消耗殆尽使细胞发生凋亡。与非逃生细胞相比，以上2种逃生细胞都有1个明显的病理生理优势，非逃生细胞在恶劣生长微环境中发生坏死，并进一步释放活性氧和其他促纤维化和促炎性分子[31]。因此提出了体内肝细胞在肝纤维化时通过EMT产生ECM而获得间充质表型的概念。越来越多的证据表明，在慢性炎症和肝纤维化过程中，发生EMT可以产生肌成纤维细胞，表明肝细胞系在纤维化进程中起作用[12]。Massimo综述表明，主要依赖于细胞标志物表达的EMT的发生被认为不包括肌纤维母细胞，但是，在肝纤维化中发生Ⅱ型EMT，肌纤维母细胞在体内最恰当的功能是病理Ⅰ型胶原蛋白的合成和沉积。Massimo认为在肝纤维化的不同动物模型中，一些肝细胞和胆管细胞获得与细胞运动和生存相关的间充质标志物，但是与有活性的纤维状细胞外基质ECM的沉积无关，因此，这些肝细胞和胆管细胞并不能被认为是发生纤维化的细胞[4]。Francisco Valde′s实验结果表明，非成人肝2/3部分被切除48 h后，再生细胞并不是终末分化细胞，可向成纤维细胞样表型的转分化。Zeisberg等在四氯化碳(CCl4)诱导小鼠肝纤维化的体内实验中通过基因谱系分析发现45%FSP-1阳性的成纤维细胞来源于肝细胞EMT，提示EMT和MET的平衡关系影响慢性肝病的转归，如果EMT占优势，肝脏修复以纤维化为主；如果MET占优势，则正常上皮增生、纤维化逆转，因此通过抑制EMT减轻或逆转肝纤维化[32-33]，可能是抗纤维化研究新的靶点。然而，Taura等研究表明在TGF-β或CCl4诱导下，小鼠肝细胞尽管形态学上发生了成纤维细胞样的改变，但在表达Ⅰ型胶原蛋白的成纤维细胞中并未找到来源于肝细胞EMT的间充质细胞。结果认为生成Ⅰ型胶原蛋白的细胞不是来源于肝细胞，体内的肝细胞既没有获得间质标志物的表达，也没有表现出形态学的改变，这强烈挑战了体内肝细胞在肝纤维化时通过EMT产生ECM而获得间充质表现的概念[34]。Beaussier等研究表明肝门间质细胞在缺血性或胆汁淤积性肝损伤引起的肝纤维化中作用明显[35]。有研究还指出成纤维细胞是肝内产生ECM的另一重要来源，这些表达胶原蛋白的细胞起源于骨髓并迁移到肝脏中相应损伤反应部位[36]。这些研究结果不尽相同，提示肝纤维化中ECM的过度产生的多种机制，以及在肝纤维中EMT所起到的作用需要更进一步的研究。

总之，EMT是原发瘤癌细胞离开有序组织结构的初始阶段，是细胞释放以致肝内传播或远处转移的先决条件，是癌转移程序启动的重要标志。由于EMT在肝癌发生中的重要作用，进一步研究将通过细胞模型和体内实验的共同分析验证、通过封闭相关信号通路动态监测EMT相关分子mRNA和蛋白的表达、以及启动子区甲基化的程度、通过逆转EMT事件中的转录调节基因，等。在研究过程中将有利于发现更多EMT分子标志物、有利于研究EMT形成的分子调控机制和功能、有利于深入剖析EMT过程与癌进展的关系。研究结果将进一步揭示诱导EMT和促进癌发生的信号通路、进一步认识肿瘤微环境对EMT的作用、进一步明确启动EMT的关键因素、进一步了解与EMT有关的肝内侵袭转移及对化疗耐药的机理，从而获得更多阻碍EMT的切入靶点，为阻断肝癌的转移和复发、为靶向肝癌治疗提供新的思路和治疗方法。

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