真菌作为生物医学材料的应用——以灵芝子实体SACCHACHITIN为例的研发过程

苏庆华



真菌作为生物医学材料的应用——以灵芝子实体SACCHACHITIN为例的研发过程

苏庆华

（台北医学大学微生物及免疫学科，台北 110）

到目前为止，SACCHACHITIN为唯一将真菌应用为生物医学材料的案例。灵芝残渣是一种坚韧的纤维。过去，学者对真菌细胞壁的研究也发现真菌细胞壁主要的组成是多糖（Polysaccharide）和几丁质（Chitin），以及一些类似黑色素（Melanin）的成分。几丁质最早发现在甲壳类之外骨骼，蟹壳几丁质在1992时已发展成为商品化的伤口敷料，对伤口愈合具有优良促进功能。灵芝残渣同样含有几丁质，其以热碱（IN NaOH 90oC）去除残余脂蛋白、核酸、脂肪再以过氧化氢漂白去除黑色素，再做成模膜，是一种滤纸状多孔性白色薄膜。此一薄膜几丁质的含量约在40%～50%，其余为以葡萄糖为主的多糖（50%～60%）的复合体，称之为SACCHACHITIN。经过一连串的细胞试验、动物试验、人体试验证实具有生物兼容性、生物降解性、并无过敏性及抗体反应；同时对急性及慢性皮肤创伤均具有极优良的愈合促进作用。其作用机理在于吸附伤口中由人体免疫细胞所产生过量的金属型基质蛋白水解脢（MMP），以及细菌所产生的蛋白水解脢，避免细菌感染，结束发炎反应，提早进入肉芽组织生长期。此作用也会保护生长因子（Growth factors, TGF, PDGF和VEGF）不受破坏而加速愈合。SACCHACHITIN的专利已进行技术转移；目前产品以镭射（激光）除斑手术的术后修复面膜，以及化妆品为商品诉求。

SACCHACHITIN；灵芝；生物医学；多糖；几丁质

真菌不仅可作为食物、药品，也可以作为生物医学材料应用。真菌对人类的帮助可谓功不可没。到目前为止，至少已有一个成功的也是唯一的案例（SACCHACHITIN）将真菌应用为生物医学材料。本文从构想、原料成分分析、原理假说证明、专利申请、产品开发、技术转移，以及市场营销等方面叙述此案例的整个过程，以期能对有趣于此之同侪后进有所帮助。

1 缘 起

1985年起，灵芝逐渐成为保健食品的宠儿，一方面灵芝在传统中药中已享有很好的声誉；另一方面因台湾气候适宜，且在蕈类栽培方面累积了很丰富的经验，在此一时间点大量商业栽培灵芝子实体已成为可能。此外一些有关灵芝生理活性的研究报告也在这段时间陆续出炉，其中包括：许多灵芝酸等三萜类新化学成分的发现，抗过敏、降血脂肪、肝障碍排除等三萜类功能的研究，降血糖、提升免疫的灵芝多糖的确定等。加上许多民间传说及文学作品的渲染，灵芝很快成为大家可接受的保健食品。

因此，对保健食品制造者而言，提高产品中三萜类及多糖含量成为产品竞争力的重要指标，但是灵芝所含的此二类成分的总和经常不超过10％。所以在制造过程中萃取三萜类及多糖后再加以浓缩，再以少量灵芝做为赋形剂，可提升三萜类及多糖在产品中的百分比，大部分灵芝子实体就成为残渣。这些灵芝残渣常作为有机堆肥或土壤改良剂而无别的明显用途。1990年我们开始思考为这些残渣寻找更好的用途，其中最可行的莫过于生物医学材料的开发。

2 生物医学材料的初期开发

灵芝残渣是一种坚韧、革质化、咖啡色的纤维，实际上就是构成灵芝子实体的菌丝细胞，在显微镜下这些细胞有很厚的细胞壁。过去，学者对真菌细胞壁的研究也发现真菌细胞壁主要组成是多糖（Polysac charide）和几丁质（Chitin），以及一些类似黑色素（Melanin）的成分[1]。几丁质最早发现于甲壳类的外骨骼，之后也在真菌细胞壁中发现同样的构造成分。蟹壳几丁质在1992时已发展成为商品化的伤口敷料，其中日本的产品叫做Beschitin，是由蟹壳几丁质纤维编织而成不织布，对伤口愈合具有优良的促进功能[2]。因此，同样含有几丁质的灵芝残渣，是否也能发展出类似功能及外观的产品就成为初期构思目标。

为此，我们检视了如何由螃蟹壳纯化几丁质的程序，发现如果从灵芝残渣来纯化几丁质过程会更简单[3]。首先，因为灵芝没有蟹壳中所含的高量的碳酸钙，可以免除酸处理（经常适用1N HCl）；而以热碱（1N NaOH 90oC）去除残余脂蛋白、核酸、脂肪及漂白去除黑色素的程序则相同。另一个更有利的条件是，灵芝残渣本身就是菌丝所构成并不需要繁复的手续做成几丁质纤维，再由这些纤维织成不织布。根据上述过程我们很快就完成产品原型（Prototype）——滤纸状多孔性白色薄膜[4]的制作。

除了灵芝具革质化、含几丁质纤维的子实体之外，是否也有其他真菌可以利用作为相同用途？我们尝试了其他一些食用及药用真菌，发现只要是具有坚韧革质化子实体的真菌几乎都可以拿来做这方面的利用，因为只有革质化的子实体才会含较高的几丁质（40％～50％）；而一般像双孢蘑菇、金针菇、香菇等可口柔嫩肉质子实体的几丁质含量经常不超过1％。因为灵芝残渣原料取得十分方便，所以理所当然成为研究的首选。另外，常用来做发酵食品糖化的根霉菌（），生长迅速，在液态黑暗培养环境下，只要5天时间就会在培养基上层形成海绵状、具有厚度的菌丝体，也可以制成类似灵芝薄膜的构造。为避免根霉菌产生黑色囊孢（Sporangium），可利用培养基组成及低产孢菌株来克服[5]，本构想正在专利申请中。

3 名称的由来

此多孔性薄膜是否具有发展性完全决定于其功能，因此先进行动物实验以大鼠背部皮肤切除法制造两个镜像伤口，敷以薄膜，及其他包括纱布及Beschitin作为对照组。2～3星期内我们惊奇地发现敷以灵芝薄膜及BesChitin的伤口以相同的速度迅速复原，而纱布对照组则离复原还有很大的距离。这结果给我们很大的鼓舞，于是就立即进行糖类分析，测试灵芝薄膜的基本组成到底是什么，在分析几个样品后答案相当一致：几丁质的含量约在40%～50％，其余为以葡萄糖为主的多糖。于是就给这一复合体命名为：SACCHACHITIN[6]，表示这是葡萄多糖与几丁质的复合薄膜。SACCHACHITIN后来在不同动物上进行的多次测试结果都非常一致，也成为测试其他伤口敷料的对照组。

4 安全性

SACCHACHITIN对人类表皮细胞及天竺鼠纤维母细胞无毒性，甚至有诱导增生的趋势[7]。对大鼠无过敏性也无抗体诱导性，殖入SACCHACHITIN于大鼠体内也不会造成发炎反应[8]，显示SACCHACHITIN是由糖类购成的复合体，具有很好的生物兼容性。

5 伤口愈合机制

SACCHACHITIN在没有干燥之前就像一般的纸浆，即使经过冷冻干燥后外表看起来就像一张很普通的滤纸，但是在伤口愈合的功效上却有突出的表现，显示多糖与几丁质的组合在生物医材的利用上具有特殊意义，这也启发我们探讨其作用机制。实际上，在一些教科书上已经可以看出一些端倪，就是真菌细胞壁的功能，除了赋予真菌细胞固定形状、保护细胞免受干、冷、热等物理条件变化的影响外，还有一个很重要的推论就是真菌细胞壁也会中和一些外来的分解性酵素，使这些具有破坏性的酶吸附在细胞壁上并失去活性，从而无法侵害到细胞内的组成。真菌细胞壁就是利用此特性，能在自然界极其复杂的微生物环境中脱颖而出。这些分解性酵素中，最为关键的应属蛋白水解酶（Proteases）。

回到人或动物皮肤创伤来思考，伤口一旦形成，细菌很快会在伤口上迅速繁殖，并分泌蛋白水解酶将蛋白质分解成氨基酸，作为细菌生长的营养来源；蛋白水解酶也可能来自人体本身的防御系统，例如：嗜中性球或巨噬细胞所释放的基质金属型–蛋白酶（Matrix metallo-proteases，简称MMP）。如不立即处置，伤口就如同战场一样以各种武器求胜，一般健康的人伤口会有发炎期（Inflammation），待入侵的微生物清除后进入肉芽生长期（Granulation），最后进入重塑期（Remodeling），使伤口恢复到接近原有的状况。一般从较小伤口（2×2 cm2）发生至复原需要3周至一个月。SACCHACHITIN可缩短这样的急性创伤（Acute wound）复原时间至少一周，原因在于SACCHACHITIN可吸附并使无论是细菌或免疫细胞产生的蛋白酶失去功能，使发炎期立即终止，迅速进入肉芽期；同时SACCHACHITIN也对纤维母细胞及表皮细胞有促进移行（Migration）的生长作用，使伤口迅速愈合。以上假说有酵素实验、细胞实验、动物实验来支持[8,9,10]。

以上所描述是针对急性创伤可能发生的状况，而另外一种情形则是慢性创伤（Chronic wound）或叫做愈合困难创伤、不愈合伤口等。慢性创伤当然是由急性创伤发展出来的，常发生在糖尿病、长期服用类固醇、感染抗药性细菌及长期卧床的病人身上。这类伤口的共同点就是在6个月内无法愈合，以抗生素处理或其他药剂无法治愈，并且在伤口组织或渗出液中含有大量过度分泌的基质金属型–蛋白酶（MMP），尤其是MMP–2及MMP–9（都是胶原蛋白分解酶）。也就是急性创伤发生后，细菌与免疫细胞的战争持续，发炎反应无法结束，SACCHACHITIN这时也就发挥抑制这些酵素的作用，在2001年进行的50例人体实验中，36人在2～3周内伤口达到完全愈合（14人没有回诊）；同时在这些病人伤口渗出液中，也检视到SACCHACHITIN处理后MMP–2及MMP–9显著减少[10]。此外，对5个褥疮病人亦有类似效用。

6 对抑制痤疮(青春痘)的延伸应用

痤疮主要因为皮肤毛囊中的皮脂腺不正常分泌过多脂肪，造成毛孔阻塞形成无氧环境，提供喜欢分解脂肪及厌氧的痤疮丙酸菌（）生长所需的良好环境，进而造成发炎，青少年乃至成人都可能发生。诚如上述SACCHACHITIN抑制蛋白水解酶机制，是否也有可能抑制痤疮丙酸菌所分泌的脂酶（Lipase）？因为脂酶将脂肪（Lipid）分解成脂肪酸（Fatty acids）及甘油（Glycerol），痤疮丙酸菌才能进一步利用其作为热量来源并以繁衍。因此，抑制脂酶就可抑制痤疮丙酸菌生长并达到抑制治疗青春痘的目的。在体外试验，SACCHACHITIN明显抑制脂酶及痤疮丙酸菌的生长(11)，非正式人体测试结果也令人满意。这也显示SACCHACHITIN除了可能作为皮肤疮伤愈合的生物医学材料外，也在化妆品或医学美容材料中扮演一些角色。

7 剂型开发

SACCHACHITIN最早为冷冻干燥的多孔性薄膜，后为能更方便涂布于伤口上而发展成软膏。经过微米化处理则可成为粒径2.0 μm的半透明悬浮液（1％～5％，w/v），作为已证实能修复角膜损伤的眼药水[12]。

8 SWOT分析

SACCHACHITIN发展至今将近20年，其安全性、功效及机制也逐渐清楚。其SWOT分析如下。

优势：（1）原料来自当地栽培灵芝残渣，原料便宜且供应充足。（2）制程相较于蟹壳几丁质医学材料更为简单。（3）相较以蛋白质为主体的生物医材，无菌处理简单，可用高压高温灭菌而不需辐射处理。（4）具有良好的生物兼容性、生物降解性、安全性及清楚的机制。（5）效果优异。

劣势：（1）虽然已完成各阶段测试，生产者仍需投入可观的资金于GLP实验室完成符合可用于人体的各项文件。（2）已开发贩卖类似产品的厂商不愿意投入以免影响原有产品的投资及市场。

机会：（1）面对全世界逐年以5.3％增加，预测2016年总金额将达393亿美元的创伤敷材市场[13]， SACCHACHITIN有机会在其中占一席之地。（2）中国大陆市场为该市场增加最为迅速的区块，极具发展潜力。

威胁：由蟹壳所生产的几丁质及几丁聚糖（Chitosan），已占有创伤敷材的市场先机，如何突破需在营销技巧上费更多心思。

9 专利、技术转移及营销

SACCHACHITIN在台湾已取得15年专利，并已技术转移给药厂，产品有面膜、软膏及凝胶，主要用于镭射除斑术后的皮肤迅速修复，主要市场为中国大陆。

[1] Alexopoulos, C. J., Mims, C. W., and Backwell, M. Introductory Mycology, 4thed.[M]. John Willey & Sons, USA, 28. 1996.

[2] http://www.unitika.co.jp/medical/e/products/beschitin/index.html.

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[12] Chen, R. N., Lee, L. W., Chen L. C., Ho, H. O. Lui, S. C. Sheu, M. T., Su, C. H.. Wound-healing effect of micronized sacchachitin (SC) nanogel on corneal epithelium[J]. Int. J. Nanomedicine, 2012(7): 4697–4706.

[13] http://www.giiresearch.com/report/fd243605-world-wound-management-products.html . Abstract for world wound management products to 2016 - Industry market research, market share, market size, sales, demand forecast, market leaders, company profiles, industry trends.

Application of Mushrooms on Biomedical Materials—R&D Process of SACCHACHITIN

Ching-Hua Su

(Department of Microbiology and Immunology, Taipei Medical University, Taipei 110)

In traditional way, the application of mushrooms can be used as food or drugs, however, in present study, the cell wall part of mushroom is also applied to biomedical materials. SACCHACHITIN is a trade name for this purpose and it is the only one case that successfully developed for wound healing enhancement and cosmetic products. The present report described the process of initiation of the idea, analysis of cell wall content, collection of evidences for the hypothesis, application of pattern and finally the transfer of the techniques for commercial application. Since 1992, chitin product from crab shell for wound healing had widely used in medication for the treatment of skin trauma. It is also known that the cell wall of fungi containing mainly polysaccharide with different percentage of chitin in mushrooms and in our case, we used fruiting body ofthat the chitin content is over 40% in weight and was considered as a suitable material for the use as a wound dressing, especially when large quantities of residual waste of fruiting bodies was left behind useless from the offunctional food factory accompanied by the extraction processing. The waste residue offruiting bodies was treated with sodium hydroxide (1N, 90oC 2hr) to remove residual protein, nucleic acid and fat and the following beaching process by hydrogen peroxide for de-pigmentation to obtain pulp-like fiber. The prototype of SACCHACHITIN was then formed through membrane manufacturer. The name of SACCHACHITIN was from the combination of polysaccharide and chitin because it containing almost equal part of both component. The bio-compatibility, bio-degradability, allergic and antigenic reaction of SACCHACHITIN was evaluated by models of cell culture, animal test as well as human trials to prove the safety. Excellent property in enhancement of wound healing was also demonstrated by SACCHACHITIN for its high binding ability with PPMs from macrophages and proteases produced by bacteria. This ability resulted in early termination of inflammation of the wound and accelerated the process of wound healing with more growth factors (TGF, PDGF and VEGF) retained active by the protection of SACCHACHITIN from the digest of proteases. The similar activity was discussed for the proteases deprivation from the bacteria that also prevent extensive growth of bacteria in the wound area. he pattern of SACCHACHITIN transfer for commercial use and products of cosmetics and face membrane for repairing of wound of lacer de-pigmentation surgery are available in market.

SACCHACHITIN；；biomedical；Polysaccharide；Chitin

R318.08

A

2095-0934（2014）01-009-05