HPLC法测定注射用核黄素磷酸钠的含量

朱永琴，程 伟，景爱华，雷万军

·基础医学·

HPLC法测定注射用核黄素磷酸钠的含量

朱永琴1，程 伟2，景爱华3，雷万军3

目的建立HPLC测定注射用核黄素磷酸钠中核黄素磷酸钠的方法。方法采用Dikma DiamonsilTM- C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相为乙腈-0.025 mol/L磷酸二氢钾溶液(20∶80)；流速：1.0 mL/min；柱温：25℃；检测波长：267 nm。结果此方法在4.01～100 μg/mL范围内线性关系良好(r=0.9999)，最小检出量为2 ng；平均加样回收率99.86%，RSD=0.19%。结论本法快速、准确、专属性和重现性好，可用于注射用核黄素磷酸钠的质量控制。

HPLC法；核黄素磷酸钠；含量测定

核黄素磷酸钠别名为维生素B2磷酸钠，为维生素类药，临床用于口角炎、唇炎、舌炎、眼结膜炎及阴囊炎等疾病的治疗[1]。由于核黄素的极性小，其保留时间较长，整个分析约需45 min，另外峰较宽，检测灵敏度较低[2]。根据中华人民共和国药典2010版二部核黄素磷酸钠含量测定项下的方法[2]和参考有关文献[3-4]，建立了高效液相色谱法测定注射用核黄素磷酸钠中核黄酸含量的方法，有效减少了分析时间，提高了检测灵敏度，适用于注射用核黄素磷酸钠质量控制。

1 材料与方法

1.1仪器与试剂LC-10ATvp高效液相色谱仪(日本岛津)；Agilent8453 紫外可见分光光度计；AB204-N型梅特勒-托利多精密分析天平(瑞士梅特勒)；SPD-10Avp检测器(日本岛津)；核黄素磷酸钠对照品(中国药品生物制品检定所，供含量测定用，批号：111640-200502)。乙腈为色谱纯，水为重蒸水，其他试剂均为分析纯。

1.2方法

1.2.1色谱条件采用LC-10ATvp高效液相色谱仪，色谱柱Dikma Diamonsil TM-C18(250 mm ×4.6 mm，5 μm)，流动相为乙腈-0.025 mol/L磷酸二氢钾溶液(20∶80)，流速1.0 mL/min，柱温25℃，检测波长267 nm。

1.2.2溶液制备避光操作。精密称取核黄素磷酸钠对照品适量，加流动相制成10 μg/mL的溶液，即得对照品溶液。同法制备核黄素磷酸钠溶液做供试品溶液。取注射用核黄素磷酸钠辅料制取成空白辅料溶液,过滤，作为空白溶液。在上述条件下，核黄素磷酸钠的保留时间为16 min，理论塔板数按核黄素磷酸钠峰计算为5610。按照处方比例称取空白辅料，按供试品溶液的制备方法制备空白辅料溶液，在上述色谱条件下，取20 μL，注入液相色谱仪，辅料对主成分的测定无干扰。

1.2.3线性关系 精密称取核黄素磷酸钠对照品适量约(相当于核黄素10.03 mg)，置50 mL容量瓶中，加流动相适量使溶解并稀释至刻度，摇匀，作为贮备液；精密量取上述贮备液0.2、0.5、1.0、2.0、3.0、5.0 mL，置10 mL量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，制成系列浓度的溶液，分别取上述溶液各20 μL，注入液相色谱仪，记录色谱图。以浓度(C)对峰面积(A)进行线性回归，得回归方程：A=3.218×10C+1.030(r=0.9999)。结果表明，核黄素磷酸钠在浓度在4.01～100 μg/mL范围内，C与A呈良好的线性关系。

1.2.4精密度试验 精密称取供试品适量，加流动相适量使溶解并稀释制成每1 mL中含有核黄素10 μg的溶液，取20 μL注入液相色谱仪，连续进样6次，测定核黄素磷酸钠峰面积并计算相对标准偏差，RSD为0.20%(n=6)。表明精密度良好。

1.2.5稳定性试验 取同一供试品溶液，按上述色谱条件分别在0、2、4、6、8、12 h进样，测定核黄素磷酸钠峰面积，并计算核黄素磷酸钠峰面积积分值的相对标准偏差，RSD为0.09%(n=6)。表明制备的供试品溶液在12 h内稳定。

1.2.6重现性试验 取同一批号样品，按供试品溶液制备方法制备5份供试液，分别进样10 μL，测定核黄素磷酸钠峰面积，并计算相对标准偏差，RSD为0.16%，表示方法重现性良好。

1.2.7加样回收试验 按照处方比例的80%、100%、120%精密称取核黄素磷酸钠对照品和辅料，置于50 mL容量瓶中，加流动相适量使溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取1 mL，置10 mL容量瓶中，按含量测定项下的方法测定，计算回收率，得平均加样回收率为99.86%，RSD为0.19%。

1.2.8最低检出限 取对照品溶液用流动相稀释制成一系列不同浓度的溶液，分别注入色谱仪,记录其色谱图。以S/N≥3计算，最低检出限为2 ng。

1.2.9样品测定 取本品适量(约相当于核黄素磷酸钠10 mg)，置于50 mL容量瓶中，加流动相适量使溶解并稀释至刻度，摇匀；精密量取1 mL，置于10 mL容量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。另精密称取对照品适量，加流动相溶解并稀释成每1 mL中含有核黄素磷酸钠0.06 mg的溶液，作为对照品溶液，取上述溶液各20 μL，按照上述色谱条件进行测定，记录色谱图，按外标法计算含量。三批样品含量测定结果分别为100.9%、100.7%和100.8%。

2 讨论

2.1检测波长选择精密称取核黄素磷酸钠对照品适量，加流动相制成10 μg/mL的溶液，通过紫外可见分光光度法在250～350 nm波长范围对核黄素磷酸钠进行光谱扫描，发现在267 nm处检测灵敏度较高且无其他干扰，故选择267 nm为检测波长。

2.2流动相选择分别以四氢呋喃-乙腈-甲醇-0.1%磷酸溶液(1∶8∶4∶87)、乙腈-水(10∶90)、乙腈-0.025 mol/L磷酸二氢钾溶液(20∶80)为流动相，对制备的对照品及供试品溶液进行色谱分析。结果发现四氢呋喃-乙腈-甲醇-0.1%磷酸溶液(1∶8∶4∶87)和乙腈-水(10∶90)均不能使样品中核黄素磷酸钠与相邻峰完全分离，乙腈-0.025 mol/L磷酸二氢钾溶液(20∶80)分离效果较好，样品中核黄素磷酸钠峰与相邻峰完全分离，可满足含量测定要求，故选择乙腈-0.025 mol/L磷酸二氢钾溶液(20∶80)为流动相。

2.3辅料干扰性试验分别精密称取注射用核黄素磷酸钠样品、核黄素磷酸钠、空白制剂(除主药核黄素磷酸钠外的制剂)适量，按上述含量测定项下的方法制成每1 mL约相当于核黄素10 μg的溶液，在250～350 nm之间进行紫外扫描，核黄素磷酸钠在267 nm波长处有最大吸收，样品溶液、对照品溶液吸收曲线完全吻合、且此处空白液相对基线平坦，说明辅料对核黄素磷酸钠的测定无干扰。

2.4其他本方法核黄素磷酸钠色谱峰唯一且显著，其他杂峰得到了有效抑制，各色谱峰峰值小，且峰与峰之间分离度达到要求，能更好地对样品的质量做出评价。

采用HPLC法测定核黄素磷酸钠含量操作方便，专属性强，重现性好，检测限低，精密度、稳定性及回收率均良好。适用于注射用核黄素磷酸钠的含量测定，为控制本品质量提供了一定的科学依据。

[1]乔丽曼,楼旦,张慧.核黄素磷酸钠在不同输液中的稳定性研究[J].中国现代医生,2010,48(28):42-43.

[2]国家药典委员会.中华人民共和国药典2010年版(二部)[S].北京:化学工业出版社,2010：815-817.

[3]邓洁雄.HPLC测定核黄素磷酸钠中核黄素的含量[J].广东药学院学报,2006,22(1):53-54.

[4]郝桂明,唐素芳.高效液相色谱法测定核黄素磷酸钠的有关物质[J].天津药学,2008,20(4):30-31.

HPLCDeterminationofRiboflavinSodiumPhosphateforInjection

ZHU Yong-qin,CHENG Wei,JING Ai-hua,et al

(Henan Province Food and Drug Institute,Zhengzhou 450003,China)

ObjectiveTo establish a HPLC method for determination of riboflavin sodium phosphate for injection.MethodsHPLC was used to determine directly riboflavin sodium phosphate for injection on C18 column with the mobile phase of CH3CN-0.025 mol/L potassium dihydrogen phosphate solution (20∶80) at a flow rate of 1.0 mL/min and column temperature was 25℃.The detection wavelength was set at 267 nm.ResultsThe calibration curve was linear in range of 4.01～100 μg/mL(r=0.9999).The limit of detection for the assay was 2 ng.The average recovery of the added sample was 99.86% and RSD was 0.19%.ConclusionThe method is quick,accurate,and has strong specificity and good reproducibility.It provides a good way for the quality control of riboflavin sodium phosphate for injection.

HPLC；riboflavin sodium phosphate；determination

国家自然科学基金资助项目(No.81071230)

2014-10-20

1.河南省食品药品检验所，河南郑州 450000 2.三门峡市公安局，河南三门峡 472000 3.河南科技大学医学技术与工程学院，河南洛阳 471003

朱永琴(1972-)，女，河南中牟人，副主任药师，从事药品检验检测研究。

R927.2

A

1672-688X(2014)04-0241-02