流感嗜血杆菌外膜蛋白及免疫特性

赵青

流感嗜血杆菌，简称嗜血杆菌(haemophilus influenzae，Hi)，该菌是由波兰细菌学家费佛博士在1892年的一次流行性感冒瘟疫中发现的，发现该菌之初，人们误以为其是导致流行性感冒的病因，到1933年流行性感冒病毒性病原体被分离出来之后，人们才消除了对此的误解。Hi可引发肺炎、结膜炎、中耳炎、会厌炎等疾病，其侵袭性的感染可导致脑膜炎和菌血症等［1］，给人类的健康带来严重的危害，据调查在欧洲流感嗜血杆菌已经成为获得性肺炎中的第二大病原菌［2］。Hi的人群携带率很高，是一些疾病的重要病原菌。该菌疫苗的获得主要是通过对其外膜蛋白的研究，因此本文主要对常见的外膜蛋白主要从其特性和抗药机制两个方面进行详细介绍，以便日后深入研究该病原体。流感嗜血杆菌，是一类革兰阴性、需氧或兼性厌氧菌，常定位于局部的呼吸道、中耳、结膜等处，其对生长的环境要求较高，且在人工培养时需加入新鲜的血液，它自身生长主要依赖于Ⅴ和Ⅹ因子。根据有无荚膜其可分为荚膜型和无荚膜型(nontypeable haemophilus influenzae，NTHi)两种类型。以往的研究指出只有荚膜型菌株可致病，荚膜型又可分为a～f六个血清型，其中又以b血清型(Hib)的侵袭力最强;然而近来的研究多显示，在感染Hi的患者中最常见的菌株是NTHi，特别是在呼吸道感染中NTHi已成为了主要致病菌［3］，它们首先寄居在鼻咽部，然后通过咽鼓管到达中耳，常引起呼吸道的反复感染。通过研究，Hi外膜蛋白(outer membrane protein，OMP)常被用做疫苗的研制来防止人类感染此病毒。Hi的外膜蛋白主要有 P6、P2、P26、P5、P4、脂蛋白 D(LPD)、Haps 蛋白、Hia蛋白等。

1 外膜蛋白P6

1.1 P6生物特性 Hlrano等［4］首次分离出外膜蛋白P6(outer membrane protein P6，P6)，证实其存在于所有Hi菌株上，研究指出其免疫交叉反应暴露于细胞表面;P6是一种肽聚糖偶联的脂蛋白，也是一个整合蛋白，其分子量为16-kDa，在所有外膜蛋白中所占比重仅为1% ～5%［5］，但其作用是不容忽视的;P6蛋白在维持细胞外膜的完整性方面具有重要作用，其锚定于NTHi菌体外膜上，通过对缺乏P6基因表达的NTHi突变体的研究表明，缺乏P6基因表达的菌株生长缓慢，其细胞壁的完整性降低，脆性增加，对β-内酰胺类抗生素具有很强的敏感性［6］;在外膜蛋白中，P6蛋白是唯一一个不溶于37℃、1%SDS-0.5 mmol/L NaCl-0.1% β-巯基乙醇溶液的蛋白，但在60℃时可释放到细胞外［7］。

1.2 P6免疫特性 P6有杀菌免疫活性。P6有一个Pam半肮氨酸末端模序，与Toll样受体信号转导系统偶联，P6能够激活TLR2，而TLR2又可激活NF-kB，进而来诱导细胞内信号传导系统的活化［8］，引起对OMP的获得性免疫应答。通过菌株的预测氨基酸序列对比表明，多菌株间的序列各不相同，然而P6菌株间的氨基酸序列差异却不大，由此可见 P6相当保守。通过P6的单抗和多抗血清检测表明，其基因序列具有高度保守性［9］，在 Hi菌株间的保守性分别为 97%、100%［10］，P6是一个位于流感杆菌表面的高度保守的抗原。

研究显示P6抗体对机体具有保护性。Demaria等［11］单独用P6蛋白免疫南美栗鼠并进行细菌的攻击实验，实验发现动物体内产生了较高的抗体，且该抗体具有保护性;这些抗体能够加速清除NTHi病原菌［12］，使得实验中动物的恢复速度增快［13］;P6在体液和细胞免疫应答及特异性黏膜免疫应答的诱导中均有重要的作用。

通过利用毛丝鼠动物模型进行的实验研究表明，当P6、PCP-PAL和P4复合物联合免疫动物时，动物能产生高滴度抗体，但该抗体却没有杀菌活性及免疫保护性，这可能是因为P6在单独免疫时形成了的二聚体受复合物的影响使得P6蛋白质的构象发生了改变，因此屏蔽了具有保护性的抗原表位，这也从另一个侧面表明P6蛋白的构象在机体产生有效抗体中扮演着重要的角色。

1.3 P6蛋白的应用 由于P6抗原的高度保守性，可疫苗研制中起十分重要作用，也是目前最有前景的疫苗候选菌株。基于P6基因的高度保守性，可用于鉴别流感嗜血杆菌及溶血性嗜血杆菌［14］。通过利用P6基因设计引物，用PCR检测极大的提高阳性率。

2 外膜蛋白P2

2.1 P2的生物特性 外膜蛋白P2(outer membrane protein P2，P2)的分子量为36～42 kD，它是具有8个外露表面环(loops)和16个跨膜区的蛋白质;它在细胞膜的表面含量约占所有OMP含量的1/2，能够形成三聚体，且具有膜孔蛋白的活性，允许小于1400 Da的分子通过［15］。

2.2 P2的免疫特性 P2具有很强的免疫原性，且P2可以通过与宿主体内的层粘连蛋白受体结合介导NTHi的粘附［16］。研究发现，P2在黏膜免疫中可针对大多数菌株(同源的和异源的)的表面抗原产生免疫应答，起到杀菌效果［17］。由于P2的免疫应答受到异源性的限制，因此对其保守抗原的研究十分必要。研究发现，表面暴露区域 loop6存在于所有菌株上，但loop6区域的保守性也是相对的。因此，用P2制作疫苗应克服外膜蛋白P2潜在的抗原异质性和点突变。

3 外膜蛋白P26

外膜蛋白P26(outer membrane protein P26，P26)，分子量为26 kD，天然的P26没有热修饰特性，它由134个氨基酸组成，携带一由23个氨基酸组成的N端信号序列。其N端和C端末端是疏水的，由亲水性区域将其分开，序列与巴氏杆菌的伴侣蛋白(seventeen—kilodal.ton protein，Skp)有一定的同源性，而且Skp家族在肠杆菌科中具有高度的保守性。有研究显示P26抗体与同源、异源菌株的清除有关［15］。

4 外膜蛋白P5

外膜蛋白P5(outer membrane protein P5，P5)，是分子量约为27 kD的一种热修饰蛋白，经实验测得的等电点为6.3～6.8，与 E.coli OmpA 同源［18］。P5可粘附于上皮细胞，是通过细胞粘附素(CEACAMs)的癌胚抗原家族尤其是CEACAM1介导的，依赖蛋白质与蛋白质之间的相互作用与CEACAMI分子结合，直接抑制机体免疫细胞活性，使得NTHi可通过跨细胞和胞吞转运作用穿过呼吸道单层上皮细胞从而感染机体［19］。

P5蛋白外露表面环根据异源性可分为loop1、loop2、loop3、loop4四种。在关于南美栗鼠动物模型的研究中，特别是在loop3基础上制备疫苗。由P5制备而成的疫苗在机体可产生体液免疫和细胞免疫两种应答机制，因而P5蛋白具有免疫保护性［20］。研究表明P5在细胞膜上对阳离子存在不对称选择性［18］，该性质在疫苗的研制方面有望成为突破，因而P5也很有希望成为疫苗候选株。

5 外膜蛋白P4

外膜蛋白P4(outer membrane protein P4，P4)，分子量为28 000～30 000，由kZ基因编码，是一高度特异的酸性磷酸单酯酶。它存在于所有Hi中，它在菌体获取凝血因子Ⅹ中具有重要作用，为细菌生长所必须。

实验研究表明，用P4免疫动物产生的抗体也具有杀菌活性。但P4是一种具有酶活性的蛋白，在人体尤其是婴儿中使用会存在很多的问题。Hotomi等［21］指出，利用定点突变方法，通过将蛋白序列上的天冬氨酸残基置换掉，在不影响其免疫原性的情况下，可显著降低P4的酶活性。虽然P4对于获取凝血因子X具有重要作用，但目前它在该过程中的具体作用尚未研究透彻。

6 其他外膜蛋白

6.1 Hia蛋白 Hia蛋白与细菌的粘附有关，是自动运输体蛋白质家族中的一员，因其在细胞内碳末端区域并未进行加工与细胞的联系完整，而又有别与其他的自动运输体蛋白，能极大的增加细菌的粘附性［22］。

6.2 脂蛋白D 脂蛋白D(LPD)是分子量为42 kD的膜相关免疫球蛋白结合蛋白，位于Hi表面，和人IgD 有亲和性［23，24］;其免疫原性高度保守，是 Hi的特征性毒力决定因子。

研究表明，脂蛋白D有甘油磷酸二酯酶的活性，可引起宿主上皮细胞释放磷酰胆碱，降低上皮细胞纤毛运动的频率，在促进黏附、吞噬及细菌侵入人单核细胞过程中表现出重要作用，但动物实验显示不能用LPD免疫来预防大鼠中耳炎。

6.3 HxuA蛋白 HxuA蛋白，分子量为100 kDa。所有的流感嗜血杆菌的生长均需一种含铁化合物，血红素，由于流感嗜血杆菌不能自身合成血红素，故其必须从人类宿主获取血红素后才能生长并引起感染;流感嗜血杆菌分泌的HxuA蛋白就是用来摄取血红素的维持自身生长的重要蛋白［15］。

7 4Sap蛋白

Sap蛋白是流感嗜血杆菌具有转导功能的蛋白，用于亚铁血红素的转导［25］。

综上所述，流感嗜血杆菌外膜蛋白的种类很多，因其高携带率和致病性，目前多用于疫苗的研制，研究较为透彻的为P6，同时由于细菌的粘附性，对于其粘附机制也可进行进一步研究。

鉴于Hi的广泛性，和外膜蛋白的多样性，在临床中我们可用其进行该菌的检测以提高检测的阳性率，或通过对外膜蛋白的清晰认识将几种蛋白融合起来用于疫苗的制备，这样对于流感嗜血杆菌的感染也可起到有效的防御。

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