葡萄酒乳酸菌分子鉴定研究进展

李 凯，田淑芬

（天津市农科院葡萄研究中心，天津 300192）

苹果酸-乳酸发酵（malolactic fermentation，简称MLF）是葡萄酒酿造中非常重要的二次发酵过程。研究发现，只有部分乳酸菌（LAB）可进行苹果酸-乳酸发酵。它们分属于酒球菌属（Oenococcus）、明串珠菌属（Leuconostoc）、乳杆菌属（Lactobacillus）和片球菌属（Pediococcus）[1]。国内外研究表明，能够适应葡萄酒环境、较专一地进行苹果酸-乳酸发酵并对酒质有增益作用的乳酸菌主要是酒酒球菌[2]，因此乳酸菌种类鉴定对于优良发酵特性菌株的筛选具有非常重要的意义。

乳酸菌分类鉴定方法可分为传统方法和分子生物学方法。传统分类鉴定方法主要是借助菌株间的表型性状，但常烦琐而耗时，且鉴定结果不够准确。分子生物学的快速发展及其在细菌分类鉴定中的应用，是细菌的分类鉴定与菌株区分方法的一次革命[3]。科学家开始从分子和基因水平认识乳酸菌的遗传结构、组成和分类，同时许多新的分子标记被用于乳酸菌的分类和鉴定，如16S rDNA序列分析、16S～23S rRNA基因间隔区（Intergenic Spacer Region，ISR）序列分析和基于 PCR技术的分子标记技术等，其中基于 PCR技术的分子标记又可分为扩增rDNA限制性酶切片段分析（Amplified RibosomalD NA Restriction Analysis，ARDRA）、随机扩增多态性 DNA（Randomly Amplified Polymorphic DNA，RAPD）、扩增片段长度多态性 （Amplified Fragment Length Polymorphism，AFLP）、限制性片段长度多态性（Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP）等[4]。

1 16S rDNA/rRNA序列分析

16S rDNA/rRNA序列同源性分析是指用特定引物对供试菌株保守序列16S rDNA/rRNA进行特异扩增，并对扩增产物测序，测序结果与GenBank中已知序列进行BLAST分析，从而实现对目的菌株的鉴定。DU PLESSIS等综合运用16S rRNA序列分析和种内特异性引物PCR来鉴定葡萄汁和白兰地生产过程中分离出的54个菌株，其中大多数是酒酒球菌（22株），但也分离出少量短乳杆菌（8株）、益生菌（8株）和植物乳杆菌（6株）[5]。Koh等（2004）通过局部16S rDNA排序和系统进化分析来进行菌类鉴定，系统进化分析中，戊糖乳杆菌和植物乳杆菌16S rDNA有99.7% 的相似性[6]。Narvaez-Zapata，J.A等利用变性梯度凝胶电泳（DGGE）来分析16S rRNA基因，他们发现龙舌兰酒中的乳酸菌群落主要由小片球菌、短乳杆菌、类布氏乳杆菌和植物乳杆菌组成，另外还在残汁中发现了魏斯氏菌属和芽孢杆菌属这些非典型的属[7]。16S rDNA/rRNA序列保守且鉴定结果的可靠，是目前细菌分类和鉴定经常使用的一种检测方法，但该方法通常进行乳酸菌菌种间的鉴定，对于高同源性的乳酸菌菌株之间分辨率不高，而且该方法费时且成本较高，在生产上的推广受到限制。

2 16S～23S rRNA间隔序列分析

16S～23S rRNA基因（ITS）是 16S rRNA 基因与23S rRNA基因的间隔序列，其进化速度是16S rRNA的10倍，具有可重复性和保守性，此外其16S rRNA端及23S rRNA端高度保守，故成为继16S rRNA后又一新位点。周利国等利用16S～23S间隔序列对4株优选菌株进行同源性分析，通过与酒明串珠菌（Leuconostoc oenos）16S～23S间隔序列比对构建聚类图，结果显示4株菌16S～23S间隔序列的同源性为100%，推知这4株菌可能为同一类菌株[8]。该方法不但可用于菌种鉴定，还可以用于分辨16S rRNA不能鉴别的高同源性菌株[9]。

3 基于PCR技术的DNA分子标记

随着DNA标记技术的不断成熟，人们建立了一系列以DNA标记为基础的微生物鉴定和检测技术，根据菌株之间遗传距离所产生的DNA指纹差异来直接反映供试菌株DNA多态性。这些技术的最大优势是可以忽略各种复杂的微生物生长条件，不需要预先培养就可鉴定和检测。多数研究结果表明，DNA标记分型技术具有从种属到菌株各种水平的鉴别能力，为乳酸菌的快速分子鉴定和分型提供了新方法[10]。

3.1 扩增核糖体DNA限制性酶切片段分析（Amplified Ribosomal DNA Restriction Analysis，ARDRA）

ARDRA基于PCR技术选择性扩增DNA片段，对所扩增片段进行限制性酶切，最后分析酶切后所得片段的多态性。该方法首先提取总DNA，以其作为模板，采用PCR技术扩增目的DNA，之后选择多种有4～6个碱基识别位点的限制性内切酶对产物进行限制性酶切，并对酶切后的DNA片段进行聚类分析[11]。

Rodas，AM等先对16S rDNA进行扩增，然后用限制性内切酶（BfaI或MseI或AluI）对扩增产物进行酶切。他们按顺序使用3种限制性内切酶简化乳酸菌鉴定，先是MseI，然后是BfaI，最后若有必要，再用AluI。这种技术可以区别出36个参照乳酸菌种类中的32个，而且可以对葡萄汁和葡萄酒中的342个菌株进行鉴定，可鉴定出这些菌株属于短乳杆菌、丘状乳杆菌、棒状乳杆菌、希氏乳杆菌、媚丽乳杆菌（益乳杆菌）、益生菌、肠膜明串珠菌、酒酒球菌、微片球菌和戊糖片球菌[12]。Manes-Lazaro，R等则综合运用16S扩增性rDNA限制性片段分析和随机扩增多态性DNA技术将西班牙博巴尔（Bobal）葡萄酒中10个乳酸菌菌株与它们的近似种区别开来[13]。

Marques，AP等发现距离16S rRNA基因5’末端大概300nt处存在酒酒球菌独有的FseI识别序列（GGCCGGCC）。对于所有的酒酒球菌菌株，用pA和pH引物扩增都能获得大约1560bp的16S rDNA扩增子，且在FseI酶切后都能获得326和1233bp的两个片段。酒酒球菌分子标记（326与1233bp片段）的检测限要求菌落数达到102～103cfu/mL[14]。

刘树文和余东亮以实验室保存的23株酒酒球菌为供试材料，对扩增的16SrDNA特异条带进行了酶切分析。结果表明，在确立的PCR体系上，均能扩增出一条长约995bp的特异条带。酶切结果显示，HindⅢ和MseⅠ酶切图谱未显示出菌株间的差别，表明了菌株间紧密的亲缘关系。AluⅠ的酶切图谱通过NT2SYSPC2.1软件生成UPGMA聚类图，在0.63水平上可以把23株菌区分为2个大类[15]。

ARDRA技术在葡萄酒乳酸菌鉴定中已经得到较好的应用，另外从理论上说，ARDRA分析中使用的限制性酶的种类越多，所产生带型越多，最后结果越准确，但使用太多酶进行ARDRA分析会加大时间、人力和经费投入，因此优化限制性内切酶的数量和种类、筛选最佳的限制性内切酶组合对于ARDRA鉴别体系应是一个不断完善的课题。

3.2 随机扩增多态性DNA技术（Random Amplified Polymorphic DNA，RAPD）

RAPD的基本原理是以基因组DNA为模板，以单个人工合成的随机多态核苷酸序列（通常为10个碱基对）为引物，在DNA聚合酶（Taq酶）作用下，进行PCR扩增。扩增产物经琼脂糖或聚丙烯酰胺电泳分离、溴化乙锭染色后，在紫外透视仪上检测多态性。扩增产物的多态性反映了基因组的多态性。

RAPD技术在乳酸菌的鉴定分型中可作为其他技术的有力补充。Spano，G等便是联合RAPD和物种特异性PCR技术对红葡萄酒中植物乳杆菌进行种水平的鉴定[16]。Capozzi，V则是先用特定引物进行PCR来鉴定酒酒球菌，然后运用多元的RAPD-PCR分析进行进一步分类。这种多元方法可筛选有良好苹乳发酵性能的酒酒球菌[17]。Solieri等用ARDRA和16S rRNA基因序列分析，鉴定出135株乳酸菌的120个酒酒球菌菌株，并运用基于M13的RAPD来研究酒酒球菌菌落的分子多样性，并提出筛选新型酒类酒球菌发酵剂的框架图[18]。Bartowsky等曾用RAPD对酒酒球菌的种内变种进行研究，他们通过RAPD成功区分澳大利亚不同产区15株菌中的10个，用4个RAPD引物和它们的基因相似性可鉴别6个商业酒酒球菌株，而来自同一个酒厂的酒酒球菌菌株则不能被区别开来。RAPD对未知来源的酒酒球菌进行分析时表现出更高灵敏度，从而能够更好的对有良好发酵性能的酒酒球菌进行基因分析[19]。Ruiz，P等运用RAPD-PCR对Tempranillo葡萄酒中的微生物群进行分类，然后用分子和传统方法进行鉴定。结果表明有一种酒酒球菌基因型在所有酒样中同时存在，这种酒酒球菌可能是当地特有的，而且可能在葡萄酒酿造过程中起重要的作用[20]。

RAPD技术相对于其它多态性检测技术来说方法简便易行，可以直接对生物DNA进行多态性分析，研究所需DNA量极少，其引物没有严格的种属局限。但是RAPD技术也存在一定局限性，它是一种显性标记，不能有效区分杂合子，稳定性差，可重复性小，对反应条件变化十分敏感。Taq聚合酶的来源、DNA的不同提取方法、PCR仪的不同型号都会影响检测的结果。因此，在RAPD研究中需要严格控制DNA模板的质量和扩增反应条件。

3.3 限制性片段长度多态性（Restriction Fragment Length Polymorphism）

RFLP是1986年由Pedersen等人发明的一项分子标记技术。限制性内切酶能够识别双链DNA分子中的特异核苷酸序列，并且在特异位点切割DNA分子，产生一系列大小各异，长短不一的DNA限制性片断。由于不同的种，菌株等个体中的DNA核苷酸序列既同源又存在遗传变异性，所以经过限制性内切酶的酶切消化，同源DNA限制片断在不同来源个体中的长度可能有所变异，这种变异就称为限制性片段长度多态性。RFLP是可以用于种内水平鉴定乳酸菌分离株的一种DNA指纹方法。Claisse，O等（2007）运用PCR-RFLP分析rpoB基因序列从而鉴定分离自葡萄酒的乳酸菌种类。先通过固体培养基和显微镜观察来区别球菌和杆细胞，之后用AciI对球菌进行单一的酶切消化，同时用AciI，HinfI和MseI对杆菌进行2个或3个酶切消化，7个球菌菌株和12个乳酸杆菌便被准确鉴定[21]。

RFLP也存在一定缺点，如要大量高纯度DNA、步骤烦琐、探针不易制备、周期长、只能检测限制性内切酶识别位点上的变异等，但是该方法可在种内水平鉴定乳酸菌菌株的DNA指纹方法，而且特别适用于构建遗传连锁图，在分析种群内和种群间的遗传差异时非常有用。

3.4 扩增片段长度多态性（Amplified Fragment Length Polymorphism）

AFLP的基本原理是对基因组DNA进行酶切，用特殊的接头连接DNA片断的两端形成特异片断，接头序列和相邻的限制性位点序列作为引物结合位点。利用PCR以及PAGE技术进行扩增和分离鉴定。AFLP比RAPD和RFLP技术有更大的优越性，主要用于流行病学及食品源性病原体毒力指标的测定研究（如李斯特杆菌和沙门菌），也可利用该技术对种族遗传关系密切的菌种（戊糖乳杆菌、植物乳杆菌和类植物乳杆菌）进行种水平的鉴定[22]。金刚利用带有一个选择性碱基的四条引物对酒酒球菌基因进行单限制性酶切扩增片段长度多态性（SE-AFLP）分析，该方法可将22株酒酒球菌完全区分开，因此SE-AFLP分子标记技术可用于酒酒球菌菌株区分[23]。AFLP具有多态性丰富，共显性表达，不受环境影响，无复等位效应，带纹丰富，用样量少，灵敏度高，快速高效等优点，已成为实验室鉴定酒酒球菌的常规方法。

3.5 聚合酶链式反应-变性梯度凝胶电泳（PCRDGGE）

PCR-DGGE是基于不同碱基序列的DNA双链解链时需要不同的变性剂浓度的原理，DNA双链一旦解链，其在聚丙烯酰胺凝胶中的电泳速度会急剧下降，因此将PCR扩增得到的等长DNA片段加入到含有变性剂梯度的凝胶中进行电泳，序列不同的DNA片段就会在各自相应的变性剂浓度下变性，发生空间构型的变化，导致电泳速度的下降，停留在与其相应的不同变性剂梯度位置，染色后可以在凝胶上呈现不同的条带。Giusto，C等先对16S rDNA基因V1区域的DNA片段PCR扩增，然后进行DGGE来鉴定葡萄酒生产中常用活性干酵母中的乳酸菌，他们鉴定出活性干酵母中的乳酸菌主要是乳酸杆菌和片球菌[24]。Ruiz，P等通过 PCR-DGGE鉴定出Tempranillo葡萄酒苹乳发酵时的菌落群体包括氧化葡糖杆菌、沙雷氏菌属、肠杆菌属的菌株以及酒酒球菌，酒酒球菌是葡萄酒苹乳发酵过程中的优势菌种[25]。

PCR-DGGE技术可以鉴定苹果酸乳酸发酵过程中乳酸菌的种群差异，另外该技术在分析微生物的遗传多样性方面也有明显的优势，但是DGGE技术一般只能分析小于500个碱基对的DNA片断，得到相关信息少，试验过程中又常出现共迁移条带，因此在分析鉴定乳酸菌时存在较大困难。鉴于此，对于复杂菌落，在进行鉴定工作时可以先通过一些方法降低其分析的复杂度。比如先根据不同的GC含量，将基因组总DNA分成各个部分，再分别进行PCR-DGGE分析[26]，从而降低分析微生物多样性时复杂度。

4 种属特异性PCR鉴定（species-specificPCR）

Zapparoli，G等设计了一对特异性引物，用于扩增酒类酒球菌编码苹果酸乳酸酶（Malolactic enzyme，MLE）基因的特异性序列，共 1025bp，并用电泳检测扩增结果，这种方法就是种属特异性PCR（species-specific PCR）鉴定[27]。

刘延琳等以Oenococcusoeni苹果酸-乳酸酶基因（mleA）为目标基因，设计了1对特异性引物PmleaL/PmleaR，直接以Oenococcus oeni的菌落为模板，通过引物对PmleaL/PmleaR的PCR扩增，可得到mleA基因的特异性条带；用此特异性引物进行供试乳酸菌的PCR鉴定，所有Oenococcus oeni菌系均得到特异性条带，而供试的其它种类乳酸菌未扩增出目标带[28]。PmleaL/PmleaR可用于Oenococcus oeni的快速PCR鉴定。Cappello，MS等联合 species-specific PCR和 16S rRNA序列分析，在220株乳酸菌中鉴定出87株为酒酒球菌[29]。王华等采用species-specific PCR对酒酒球菌进行鉴定，尝试通过优化反应体系和反应条件，直接使用菌液和菌落作为模板进行扩增。在优化后的反应体系下，可直接使用菌液或菌落作为模板进行扩增，扩增结果稳定，条带清晰[30]。种属特异性鉴定方法快速可靠，节约成本，可被广泛应用于酒类酒球菌的鉴定。

5 荧光原位杂交法（FISH）

荧光原位杂交法（FISH）是采用免疫荧光标记的寡核苷酸探针与目标检测物进行原位杂交，计算杂交率来定量检测和鉴定细菌。Blasco，L等提出了一种基于FISH快速鉴定乳酸菌的方法，运用于葡萄酒中常见乳酸菌16S rDNA同源的荧光寡核苷酸探针进行鉴定。该方案在36个参照菌株的杂交的基础上对乳酸菌进行特定检测，探针的专一性可用纯培养进行评估。探针可鉴定不同葡萄酒中的乳酸菌种类，这使得对不经过培养的自然样本进行直接的鉴定和量化成为可能[31]。

荧光原位杂交法在乳酸菌快速鉴定中有广阔的发展前景，在4～16h便可以得出比较准确的鉴定结果。FISH可优先检测数量上占优势的细菌。与PCR方法相比，它不需要选择性纯化或扩增，可提供一个更详细的微生物图谱。

6 序列特异性扩增区（Sequence—characterized Amplified Region，SCAR）

SCAR标记是将目标RAPD片段进行克隆并对其末端测序，根据RAPD片段两端序列设计特异引物，对基因DNA片段进行PCR特异扩增，把与原RAPD片段相对应的单一位点鉴别出来。Solieri，L和 Giudici，P使用SCAR方法鉴定苹乳发酵中的酒酒球菌菌株。试验以酒酒球菌LB221为模板菌株，基于特异性的PAPD片段，在原先的RAPD引物两端延伸9～13个碱基设计出SCAR标记引物，该特异引物可以扩增出LB221特有的唯一条带[32]。

SCAR标记是共显性遗传，待检DNA间的差异可直接通过有无扩增产物来显示。SCAR可以用于酒酒球菌或者是其它乳酸菌的株间鉴定，而且该方法方便、快捷、可靠，可以快速检测大量个体，结果稳定性好，重现性高，但关于葡萄酒乳酸菌的SCAR标记研究较少，因此SCAR标记对于酿酒乳酸菌的株间鉴定以及对优良性状连锁基因的标记具有很广阔的研究空间。

7 脉冲场凝胶电泳

脉冲场凝胶电泳（PFGE，Pulsed Field Gel Electrophoresis）是一种分离大分子DNA的方法。在普通的凝胶电泳中，大的DNA分子（>10kb）移动速度接近，很难分离形成足以区分的条带。在脉冲场凝胶电泳中，电场不断在两种方向（有一定夹角，而不是相反的两个方向）变动。DNA分子带有负电荷，会朝正极移动。相对较小的分子在电场转换后可以较快转变移动方向，而较大的分子在凝胶中转向较为困难。因此小分子向前移动的速度比大分子快。脉冲场凝胶电泳可以用来分离大小从10kb到10Mb的DNA分子。Lopez等利用脉冲场凝胶电泳和随机扩增多态性DNA技术对植物乳杆菌和酒酒球菌进行了基因典型化分析。脉冲场凝胶电泳可以用来鉴别、检测葡萄酒发酵过程中的菌株，对植物乳杆菌和酒酒球菌菌株的辨识能力较高[33]。

8 总结与展望

葡萄酿酒乳酸菌在葡萄酒酿造，特别是干红葡萄酒酿造中起着重要的作用。乳酸菌表型生化鉴定法耗时耗力，而且培养和生化鉴定结果易受到培养条件等诸多因素的影响，且主要缺点在于无法反应菌株的核酸信息。而分子鉴定，特别是基因型鉴定法准确、快速、灵敏，且分辨率高，已广泛用于酿酒乳酸菌的分类鉴定。但是由于每种方法基于的原理不同和各种检测方法的优势不同，各种方法都有一定的选择性和局限性。目前，还没有一种方法能单独完成各种物种各种水平的检测。所以，只有联合各种鉴别方法，充分利用各种方法的优势，才能得到更为便捷、准确和灵敏的乳酸菌的分类和鉴别。

［1］Maicas S.The use of alternative technologies to de

velop malolactic fermentation in wine［J］.Appl Microbiol Biotechnol，2001，56（3）：35-39.

［2］张春晖，夏双梅，李 华.酒类酒球菌的分离和发酵适应性研究［J］.中国食品学报，2004，（2）：35-38.

［3］张春晖.中国优良酒酒球菌（Oenococcus oeni）的分离筛选及苹果酸-乳酸发酵研究［D］.西安：西北农林科技大学博士论文，2001.

［4］庞会利，谈重芳，蔡义民，等.乳酸菌分类鉴定方法的研究进展［J］.中国酿造，2009，（6）：1-5.

［5］Du Plessis HW，Dicks LMT，Pretorius IS，et al.Identification of lactic acid bacteria isolated from South African brandy base wines ［J］.International Journal of Food Microbiology，2004，91（1）：19-29.

［6］Koh SK，Lee JE，Kim HW，et al.Identification and deacidification of lactic acid bacteria in Korean red wine.FoodScienceand Biotechnology，2004，13（1）：96-99.

［7］Narvaez-Zapata JA，Rojas-Herrera RA，Rodriguez-Luna IC，et al.Culture-Independent Analysis of Lactic Acid Bacteria Diversity Associated with Mezcal Fermentation［J］.Current Microbiology，2010，61（5）：444-450.

［8］周利国，刘树文，李西柱，等.利用 16S～23S rDNA 间隔序列对葡萄酒中的酒酒球菌的鉴定［J］.酿酒科技，2009，（5）：39-41.

［9］LeblondBourgetN，PhilippeH，ManginI，etal.16S rRNA to 23S internal transcribed spacer sequence analyses reveal inter-and intraspecific Bifidobacterium phylogeny ［J］.International Journal of Systematic Bacteriology，1996，46（1）：102-111.

［10］杨振泉，顾瑞霞.DNA标记技术在乳酸菌分类鉴定中的应用［J］.中国乳品工业，2005，33（5）：352-391.

［11］Vaneechoutte M，Riegel P，Debriel D，et al.Evaluation of the applicability of amplified rDNA restriction analysis（ARDRA）to identification of species of the genus Corynebacterium ［J］.Research in Microbiology，1995，146（8）：633-641.

［12］Rodas AM，Ferrer S，Pardo I.16S-ARDRA，a tool for identification oflactic acid bacteria isolated from grape must and wine ［J］.Systematic and Applied Microbiology，2003，26（3）：412-422.

［13］Manes-Lazaro R，Ferrer S，Rossello-Mora R，et al.Lactobacillus oeni sp nov.，from wine［J］.International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology，2009 ，59：2010-2014.

［14］MarquesAP，Ze-ZeL，San-RomaoMV，etal.A novel molecular method for identification of Oenococcus oeni and its specific detection in wine［J］.International Journal of Food Microbiology，2010，142：251-255.

［15］刘树文，余东亮.酒酒球菌不同菌株的16S rDNA PCR-RFLP 分析［J］.西北农业学报，2010，（6）：181-186.

［16］何荣，窦丽芳，董玲.分子技术在食品乳酸菌分类和鉴定中的应用［J］.现代商贸工业，2010，（16）：321-322.

［17］Capozzi V，Russo P，Beneduce L，et al.Technological properties of Oenococcus oeni strains isolated from typical southern Italian wines［J］.Letters in Applied Microbiology，2010，50（3）：327-334.

［18］Solieri L，Genova F，De Paola M，et al.Characterization and technological properties of Oenococcus oeni strains from wine spontaneous malolactic fermentations：a framework for selection of new starter cultures［J］.Journal of Applied Microbiology ，2010，108（1）：285-298.

［19］Bartowsky EJ，McCarthy JM，Henschke PA.Differentiation ofAustralian wine isolatesofOenococcus oeniusing random amplified polymorphic DNA（RAPD）［J］.Australian Journal of Grape and Wine Research，2003，9（2）：122-126.

［20］Ruiz P，Izquierdo PM，Sesena S，et al.Analysis of lactic acid bacteria populations during spontaneous malolactic fermentation of Tempranillo wines at five wineries during two consecutive vintages ［J］.Food

Control，2010，21（1）：70-75.

［21］Claisse O，Renouf V，Lonvaud-Funel A.Differentiation of wine lactic acid bacteria species based on RFLP analysis of a partial sequence of rpoB gene［J］.JournalofMicrobiologicalMethods，2007，69（2）：387-390.

［22］Giraffa G，Gatti M，Rossetti L，et al.Molecular diversity within Lactobacillus helveticus as revealed by genotype characterization［J］.Applied and Environmental Microbiology，2000，66（4）：1259-1265.

［23］金刚.中国葡萄酒主产区酒酒球菌的鉴定及SE-AFLP分析［D］.西安：西北农林科技大学，2010

［24］Giusto C，Medrala D，Comi G，et al.Application of PCR-DGGE for the identification of lactic acid bacteria in active dry wine yeasts［J］.Annals of Microbiology，2007，57（1）：137-141.

［25］Ruiz P，Sesena S，Izquierdo PM，et al.Bacterial biodiversity and dynamics during malolactic fermentation of Tempranillo wines as determined by a culture-independent method（PCR-DGGE）［J］.Applied Microbiology and biotechnology，2010，86（5）：1555-1562.

［26］HolbenW E，FerisK P，KettunenA，eta1．GC fractionation enhances microbial community diversity assessment and detection of minority populations of bacteria by denaturing gradient gelelectrophoresis［J］.Appl Environ Microbiol，2004，70：2 263-2270.

［27］Zapparoli G，Torriani S，Pesente P，et al.Design and evaluation of malolactic enzyme gene targeted primers forrapid identification and detection of Oenococcus oeni in wine ［J］.Letters in Applied Microbiology，1998，27（5）：243-246.

［28］刘延琳，李华.酒酒球菌的快速特异性PCR鉴定［J］.微生物学杂志，2006，26（6）：26-29.

［29］Cappello MS，Stefani D，Grieco F，et al.Genotyping by Amplified Fragment Length Polymorphism and malate metabolism performances of indigenous Oenococcus oeni strains isolated from Primitivo wine［J］.International Journal of Food Microbiology，2008，127（3）：241-245.

［30］王华，金刚，李翠霞，等.酒类酒球菌快速特异性PCR鉴定体系的优化［J］.中国酿造，2010，（5）：152-155.

［31］Blasco L，Ferrer S，Pardo I.Development of specific fluorescent oligonucleotide probes for in situ identification of wine lactic acid bacteria［J］.Fems Microbiology Letters，2003，225（1）：115-123.

［32］Solieri L，Giudici P.Development of a Sequence-Characterized Amplified Region Marker-Targeted Quantitative PCR Assay for Strain-Specific Detection of Oenococcus oeni during Wine Malolactic Fermentation ［J］.Applied and Environmental Microbiology，2010，76（23）：7765-7774.

［33］Lopez I，Torres C，Ruiz-Larrea F.Genetic typification by pulsed-field gel electrophoresis（PFGE）and randomly amplified polymorphic DNA （RAPD）of wild Lactobacillus plantarum and Oenococcus oeni wine strain［sJ］.European Food Research and Technology，2008，227（2）：547-555.