主要碱性蛋白与气道高反应性关系的研究进展

王海涛，方以群

气道高反应性(airway hyperresponsiveness，AHR)是过敏性哮喘的显著特点，可直接导致哮喘患者气管平滑肌和支气管发生过度收缩，引发一系列以小支气管明显痉挛收缩为特征的临床病症［1］。主要碱性蛋白(major basic protein，MBP)是一种活化嗜酸性粒细胞(eosinophil，EOS)脱颗粒产生的低分子量、高阳离子蛋白，是包括支气管哮喘在内的多种气道炎症性疾病的主要标志物之一［2］。MBP能够通过抑制神经元M2型毒蕈碱受体(muscarinic M2receptor，M2R)功能，引发大量乙酰胆碱(acetylcholine，ACh)的释放，导致支气管收缩和AHR。本综述对MBP结构、功能作用及其与AHR的关系等的研究情况进行介绍。

1 MBP的结构

MBP不仅存在于EOS，而且在肥大细胞和嗜碱性粒细胞内也有一定表达。人类MBP基因序列定位在11号染色体，人类MBP与豚鼠MBP抗血清存在交叉反应性，两者的单克隆抗体也存在＞86%的交叉反应性。

MBP是一个序列特征不显著的C型凝集素(CTL)超家族成员。人MBP包含117个氨基酸残基，其中有17个精氨酸残基和7个赖氨酸残基，还含有9个半胱氨酸残基［3］。MBP最初是以1个含222个氨基酸残基的前体蛋白形式(pro-MBP)合成的，包含1个16-氨基酸残基信号肽、89个氨基酸残基前体片段和含117个氨基酸残基。在pro-MBP胞内转运至进行蛋白酶解加工过程和MBP储存在EOS颗粒期间，强酸性前体片段发挥了中和基本MBP结构域作用的效能。第1基因座控制区(pro-MBP 123～150氨基酸残基)主要有显著细胞毒性;第2基因座控制区(pro-MBP 194～222氨基酸残基)在促进嗜碱性粒细胞释放组胺方面更具高效性［4］。pro-MBP在细胞质颗粒中水解生成14 kD MBP，储存在EOS分泌性“特异”颗粒的高电子密度的结晶核心。EOS活化后，MBP被分泌到分泌小泡，逐步以脱颗粒的形式释放［5］。

2 MBP对呼吸系统的病理生理作用

MBP对肿瘤细胞及脾脏、肠道、内皮细胞、气道上皮细胞等哺乳动物的多种细胞有毒性作用。MBP能激活组胺释放和减弱细胞免疫应答，促进炎症进程。MBP能够引发气道上皮细胞损伤，增加气道上皮细胞前列腺素合成，诱导嗜碱性粒细胞和肥大细胞释放组胺，介导气道平滑肌收缩，加速气道水肿发生，提高气道对致痉原的反应性等。Kato等［6］的研究表明，MBP可损伤呼吸道合胞体病毒感染的支气管上皮细胞，说明MBP与呼吸道合胞体病毒感染诱发的哮喘急性加重有关。

MBP是M2R选择性、内源性变构拮抗剂。肺脏含有M2R、M3型毒蕈碱受体(M3R)等多种亚型毒蕈碱受体。肺的副交感神经末稍释放的ACh激活M3R，作用于气道平滑肌，引发其收缩，导致支气管收缩。同时，副交感神经的ACh释放到神经末梢时会受到M2R的抑制作用。应用选择性拮抗剂阻断神经性M2R的负反馈抑制作用，可8～10倍地增大电刺激迷走神经引发的支气管收缩效果。相反，应用毛果芸香碱兴奋M2R可降低上述效果的80%［7］。MBP能够显著增强肺C纤维对于肺膨胀和化学性刺激的敏感性。C型输入神经纤维激活后，输入感受器编码以动作电位形式的神经冲动传至中枢神经系统，诱发肺化学反射(包括呼吸暂停、心动过缓和低血压)和其他诸如支气管收缩、支气管血管舒张、呼吸困难和咳嗽等心肺反射［2］。MBP通过增强内向电流及动作电位的途径对肺感觉神经元发挥直接的电荷依赖的长效致敏效应，导致在病理生理条件下发生与EOS气道渗入有关的AHR。75%迷走神经的支气管肺传入纤维是无髓鞘(C类)纤维，兴奋后能引发支气管收缩、黏液分泌过多及其他由胆碱能反射和内源性速激肽类介导的对气道功能的影响［8］。MBP可引起肥大细胞和嗜碱性粒细胞释放组胺、活化嗜中性粒细胞和肺泡巨噬细胞，直接与哮喘的上皮细胞损害、支气管痉挛等相关。向猴子肺内灌注MBP，除了可引起支气管痉挛外，还可使支气管高反应性增高10倍［9］。另外，MBP还可通过蛋白激酶C和细胞内Ca2+介导II型肺泡壁细胞对磷脂酰胆碱的分泌［10］。

3 MBP表达的影响因素

MBP mRNA的表达水平随着EOS的发育而逐步增加，随着EOS的成熟而减少。EOS始于造血干细胞和骨髓祖细胞的分化过程，最初受白细胞介素3(IL-3)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和IL-5的调控;随后，IL-5特异地影响EOS的终末分化、功能激活等。

EOS经CC-基序趋化因子受体3(CCR3)激动剂募集到气道神经周围及经细胞内细胞黏附分子1(ICAM-1)和血管细胞粘附分子(VCAM)黏附到气道神经上，通过钙内流、增加CD11和CD18表达、活化ERK和p38 MAPK、增加生成活性氧、肌动蛋白聚合和脱颗粒及EOS活化趋化因子、P物质、ICAM-1和VCAM等激活EOS，释放MBP。除EOS活化趋化因子外，EOS活化趋化因子-2，-3、单核细胞趋化蛋白-2，-3，-4、RANTES、CCL15和CCL28等与CCR3结合的趋化因子也可能参与了对EOS的激活过程［11］。

ICAM-1和EOS活化趋化因子是EOS化学诱导至神经的关键因子。TNF-α能上调EOS活化趋化因子和ICAM-1的表达，还能增加 IL-5的表达和降低 M2R mRNA稳定性。TNF-ɑ可能间接增加EOS增殖，迁移和黏附到副交感神经上，促进EOS募集反应，增加生成MBP，抑制M2R功能［12］。

另外，GM-CSF、IL-1、IL-3、IL-5可能对EOS有不同程度的活化作用。Meyts等［13］研究显示，IL-12抗体可降低支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)中CD4+T细胞数量和IL-4、IL-5、IL-13水平及肺IL-10、EOS活化趋化因子、RANTES、MCP-1、VCAM-1 mRNA表达水平;在气道激发阶段通过干扰素 γ介导，减低 EOS活化趋化因子、RANTES、MCP-1、VCAM-1 mRNA的表达水平，说明IL-12很可能通过上述细胞因子影响MBP的生成。

除上述影响因素外，EOS颗粒发育基因(eosinophil granule ontogeny，EGO)——一种新发现的非编码RNA表达基因被沉默后，MBP mRNA的表达水平仅为对照的9%，表明EGO是MBP基因正常转录表达的一个必要因子［14］。另外，GATA-2在MBP P2启动子反式激活过程中充当了GATA-1的竞争性抑制剂，也能抑制GATA-1约50%活性，发挥对MBP表达的负向调节作用。

4 MBP调控的细胞因子

MBP可显著上调ET-1、TGF-ɑ、TGF-β1、EGFR、PDGF-β、MMP-9、腱糖蛋白和纤维连接蛋白的mRNA表达水平，下调MMP-1基因表达水平，促进MMP-1、MMP-9、ET-1、PDGF-AB蛋白分子生成，在支气管上皮修复、肺气管结构重塑、诱导成纤维细胞分化为成肌纤维细胞及调控气道平滑肌细胞增殖、趋化、激活、细胞外基质的更新、降解等过程中发挥重要作用。MBP还可与IL-1ɑ和TGF-β1协同增加IL-6类细胞因子mRNA和蛋白质的生成量［15］。

MBP能诱导肥大细胞和嗜碱性粒细胞组胺释放、EOS和成纤维细胞IL-8分泌、前列腺素和离子分泌，与哮喘等变态反应性疾病的介导机制有关。在气道上皮细胞，MBP可增加前列腺素E2和F2ɑ的合成，减弱纤毛运动性，诱发细胞损伤［16］。MBP可激活上皮细胞表面的钙感受器，促进成纤维细胞生长因子9生成，导致基底细胞增生［17］。Page等［18］研究表明，MBP可有效刺激中性粒细胞，通过调控IL-8的基因转录增加生成IL-8，导致急性哮喘及其他炎症性肺疾病的发生。MBP也能短暂升高MIP-1α和MIP-1β mRNA表达水平，但未能促进MIP-1α或MIP-1β的蛋白生成量。

5 MBP与AHR的关系及其在病理过程中的作用

在绝大多数动物中，气道M2R的含量明显高于M3R(由于动物种系不同，M2R含量为毒蕈碱性受体总量的50%～80%)。经检测M2R和M3R mRNA存在于人类支气管中［1］。M2R功能的降低与病毒感染、变应原激发、臭氧暴露、有机磷酸盐暴露和哮喘病理过程中发生的AHR密切相关。应用肝素中和MBP对M2R的拮抗作用，快速恢复M2R功能可有效逆转 AHR［19］。气管内滴入 MBP可诱发支气管收缩和AHR［8］。依那西普、地塞米松可通过抑制EOS募集至气道神经周围，保护神经元M2R功能免受MBP拮抗作用而阻止AHR的发生［12，20］。

AHR的主要机制是MBP阻断副交感神经M2R对ACh释放的抑制功能，增加释放到气道平滑肌上M3R的ACh量和增强迷走神经诱发的支气管收缩。阻断M2R功能可5～10倍地增大迷走神经诱发的支气管收缩。EOS经CCR3激动剂募集到气道神经周围，经ICAM-1、VCAM黏附到气道神经上，释放MBP。阻断或抑制EOS向肺的迁移及阻断MBP抑制功能均能有效保护M2R功能，阻止AHR发生。

在正常生理条件下，副交感神经末梢对ACh的释放受M2R抑制。ACh或毛果芸香碱等毒蕈碱激动剂兴奋M2R，通过抑制ACh的释放减轻迷走神经诱发的支气管收缩。相反，M2R功能的丧失或被拮抗剂阻断将导致ACh释放增多，增强诱发支气管收缩。MBP抗体阻止了M2R功能障碍及其相关的AHR的发生，说明是MBP阻遏了神经元M2R功能，导致了AHR。在急性副流感病毒感染、变应原致敏和激发及臭氧的急性暴露所导致的哮喘中，肺副交感神经上的M2R均发生了功能障碍，表明M2R功能缺失是AHR重要的病理机制。MBP可阻遏M2R功能，显著增加ACh释放量，增大10倍迷走神经诱发的支气管收缩效果［1］。在致命性哮喘患者和变应原激发的动物模型的气道神经周围，活化的EOS簇生成群，脱颗粒生成MBP，阻断M2R功能消除对ACh释放的负反馈性调控作用，增加气道张力和增强迷走神经介导的支气管收缩。EOS在M2R功能缺失和继发的AHR的病理过程中发挥了特有的作用［11］。另外，M2R还能经活化的腺苷酸环化酶抑制平滑肌舒张，增加释放的ACh可能进一步增强M2R介导对腺苷酸环化酶的抑制作用。当然，M2R的合成减少也可能是其功能降低的病理机制［1］。

另外，气道平滑肌内的M3R经百日咳病毒毒素肺敏感性G蛋白(GTP-结合调节蛋白)与磷脂酶C偶联，激活的磷脂酶C再催化由膜磷脂磷脂酰肌醇4，5-二磷酸生成肌醇三磷酸、二酰甘油和经激活的蛋白激酶发生蛋白质磷酸化，也可介导气道平滑肌收缩［1］。

6 结束语

EOS募集到气道神经，活化后释放MBP，抑制M2R对副交感神经ACh释放的负性调节作用，引起ACh释放明显增多，作用于气道平滑肌上M3R，导致发生AHR。显而易见，EOS(特别是活化的EOS)和MBP与AHR直接相关。但是，以往研究在哪些检测指标能较为准确地反映三者之间关系的问题上存在一定的分歧。有研究表明，在支气管哮喘的病理生理过程中，EOS脱颗粒的意义要远大于其数量的增多［21］。AHR与BALF或气道组织中的EOS含量没有直接相关性，但与沉积在气道和气道神经周围的MBP和活化EOS的含量密切相关。相一致的是，Evans等［20］的研究表明，地塞米松在通过抑制EOS募集至气道神经周围，保护神经元M2R功能免受MBP拮抗作用而阻止AHR发生时，并没有引起BALF中EOS含量变化。Yost等［19］的实验结果还显示，豚鼠在臭氧暴露后，肺EOS数量在14 h开始减少;随后在48 h开始明显增多，至少维持至少4 d，说明EOS数量并不是维持不变的，而是随着病程演进反复变化的。相反，Homma等［22］研究却表明，BALF中EOS数量和MBP水平与哮喘的严重程度具有相关性。在死因为哮喘持续状态的患者中，MBP存在于受损上皮细胞的表面和气道黏膜和黏液中，完全抑制呼吸上皮纤毛运动和对呼吸上皮造成毒性损害，发生AHR，表明严重哮喘与气道管腔内EOS和MBP存有重要的关联。

笔者认为，在研究EOS、MBP与AHR关系及其相关的呼吸系统疾病时，应尽量以气道黏膜、神经周围蛋白分子(EOS应以在气道神经周围活化的EOS作为检测指标)及其基因表达作为主要依据，而以其在BALF、组织及血浆中的表达结果作为参考，进行MBP相关性分子生物学功能及机制的研究，才能获得可信度高的实验结果。

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(本文编辑:甘辉亮、莫琳芳)