宁波市2004-2013年麻疹野病毒分离株的RT-PCR检测与分析

顾文珍，傅 燕，张 姝，胡逢蛟，潘兴强，许国章

麻疹是一种危害严重、传染性极强的急性呼吸道传染病，又是一种疫苗可预防传染病。但宁波每年都有病例，为探究宁波2004-2013年分离的麻疹病毒的来源，特对分离的31株麻疹病毒进行基因测序和分析。

1 材料与方法

1.1病毒来源 2004-2013年在宁波市传染病医院就诊病人，采集出疹3 d内的疑似麻疹病人的含漱液标本102份，离心取上清，加入终浓度含1 000 U/mL的青霉素和链霉素、50 U/mL的两性霉素，4 ℃作用2 h后接种在75%淋巴信号激活因子转染的非洲绿猴肾细胞(Vero/SLAM)上，37 ℃吸附1 h后弃上清，换含2%胎牛血清的细胞维持液，37 ℃、5%CO2培养，每天观察致细胞病变(cytopathiceffect，CPE)，当CPE≥75%时收获冻存，如果没有病变，反复冻融3次，再盲传两代，收集细胞。

1.2核糖核酸(Ribonucleic Acid,RNA)的提取，按照德国QIAGEN公司的Rneasy Mini Kit(74104)按试剂盒说明书提取麻疹病毒RNA。

1.3引物 研究所用麻疹病毒N基因片段扩增引物根据文献[1]设计，序列如下：MN-R，5′-GCCATGGGAGTAGGAGTGGAAC-3′(1113～1134)；MN-F，5 ′-CTGGCGGCTGTGTGGAC C T G - 3 ′(1737～1754)。扩增片段大小为660 bp。

1.4系列扩增和分析逆转录-聚合酶链反应(Reverse Transcription-Polymerase-Chain Reaction,RT-PCR)采用日本TaKaRa one-step RNA PCR kit(AMV)试剂。取5 μL麻疹病毒的RNA提取物作为模板，反应条件如下：50 ℃ 30 min逆转录，94 ℃ 4 min变性后，PCR循环如下：94 ℃ 45 s，56 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，循环35周，72 ℃延伸10 min。扩增后产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定。核苷酸序列测定及分析扩增后产物送上海英骏公司进行序列测定。测序结果的序列处理分析使用了DNAMAN软件，其余参比的代表株序列均来自基因(GenBank)。

2 结 果

2.1病毒分离结果 102份含漱液标本有31份发生细胞融合病变，经过荧光PCR方法检测证实为麻疹病毒，麻疹病毒分离成功率为30.4%，其中2004年3株、2005年5株、2007年3株、2008年10株、2012年2株、2013年8株。

2.2RT-PCR结果 所有31株病毒经RT-PCR均扩增出N基因碳末端的660 bp的特异性条带。

2.3N基因末端450个核苷酸系列分析和同源性比较 31株麻疹病毒N基因碳末端450 bp核苷酸序列与GenBank中麻疹病毒各基因型参考株比较发现：2004-2013年宁波分离的31株麻疹病毒基因型均为H1型，其中6株为H1b基因亚型，包括2004年的1株 (NB2004-03)和2005年的所有毒株，其余的25株均为H1a亚型。31株麻疹病毒与H1a亚型参考株china93-4的同源性为97.1%～100%；与H1b亚型参考株china94-7的同源性为96.7%～100%；与中国疫苗株S191的同源性为81.9%～92.4%。与GenBank中录入的江浙沪地区分离株核苷酸同源性较高，与上海分离株同源性为97.8%～99.6%；与江苏省分离株同源性为98.0%～99.3%；与浙江省周边县市区分离株同源性为98.0%～99.3%。

2.4分离株与疫苗株氨基酸系列比对 31株N基因末端450 个核苷酸翻译的氨基酸与中国疫苗株S191的同源性为87.2%～90.6%，在14个位点31株分离株的氨基酸系列完全相同，但与疫苗株S191不同，具体差异见表1。

表1宁波麻疹病毒分离株与疫苗株S191N基因羧基末端450个核苷酸翻译的氨基酸系列比对分析

Tab.1Deducedaminoacidsequencesofthe450C-terminusnucleotidesequencesoftheNgenebetweenstrainsisolatedfromNingboandS191

位点Site404405430446449450469474478480504515517521疫苗株S191KIRASYGTPSSTHN宁波分离株Strains isolated from NingboRTGTNSSISYLRYD

3 讨 论

自从1963年麻疹减毒活疫苗的广泛使用，麻疹的发病率和死亡率急剧下降，但在疫苗可以预防疾病中依然是引起儿童死亡的第1位原因，在2008年，麻疹病毒世界范围引起164 000名儿童死亡[2-3]。麻疹病毒的基因型别具有地理分布特征，不同地区有不同的本土流行株或优势流行株。监测麻疹病毒的基因特征对分析病毒的起源、基因变异和传播途径，辨别疫苗株和野毒株以及制定巩固消除麻疹成果具有重要意义。

宁波市2004-2013年共分离到31株麻疹病毒，主要集中在2004年、2005年、2007年、2008年、2012年和2013年这6年，这一现象正好与这几年宁波的流行高峰相关。仅2004年和2005年流行株为H1b亚型，其余25株均为H1a亚型，H1a亚型毒株与2009-2011年间江浙沪地区分离的野毒株在系统进化树的分支上比较接近，其核苷酸同源性比较高，与国内相关文献对麻疹毒株基因流行的优势毒株研究的也报道一致[4-6]。31株毒株中，每一年的优势株形成一个小的分支，核苷酸之间的差异为零或者很小。不同年份也有基因系列完全相同的毒株在流行，表明存在同一毒株的持续循环现象；还有同一年份分离的毒株处在不同分支，表明病毒在自然选择及免疫压力下存在一定变异，导致出现较多分支，呈现不同的病毒传播链[7]。

徐闻青与严菊英等报道麻疹免疫者产生的中和抗体水平低于自然感染者，疫苗产生的抗体中和野病毒株的能力低于中和疫苗株，这些均说明现用的MV 对当今麻疹病毒流行株的保护作用已下降，但这种保护作用的下降可能仅处于量变过程，并已影响到MV 的免疫持久性[8-10]。宁波31株分离株与中国疫苗株S191的核苷酸在基因水平上存在较大差异，同源性较低，为91.1%～92.4%，翻译的氨基酸的差异性高达9.4%～12.8%，据文献报道，N蛋白上有3个抗原决定簇NP1、NP2、NP3，分别位于122～150、457～476、519～525位氨基酸[12]。宁波31株分离株与疫苗株14个不同的氨基酸系列位点，10个位点位于抗原决定簇或附近，这些氨基酸位点的变异均可能导致一定程度的抗原性改变，也从分子水平间接证明现行MV的血清学保护性降低的量变结果，基因和蛋白水平的变化为现用疫苗的持续监测和新疫苗的开发提供了有力的参照。

随着麻疹野毒株N基因的变异，由麻疹疫苗诱导的免疫是否能保护野病毒株的攻击，以及保护年限的多少将是一个重要的研究课题。因此，我们以后要从分子生物学和免疫学上加大对宁波流行的麻疹野毒株的监测，为宁波更好的消灭麻疹和巩固成效提高理论依据。

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