脂多糖对幼年哮喘大鼠Toll样受体4及气道炎症的作用

马力 王亚亭

支气管哮喘简称哮喘，是严重威胁公共健康的慢性肺部炎症性疾病。因环境因素对其发病起着重要的作用，故Strachan提出了卫生假说。Toll样受体(Toll like receptor，TLR)的发现为卫生假说提供了理论依据。TLR4主要识别革兰阴性菌的脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)成分，参与调节Th0细胞向 Th1或 Th2细胞增殖分化［1］。其中Th1应答对哮喘有保护作用，Th2能促进哮喘气道变态反应性炎症的形成。本课题针对不同浓度脂多糖对哮喘大鼠肺组织Toll样受体4表达及气道炎症的影响进行研究。

1 材料与方法

1.1 实验动物 清洁级雄性健康SD大鼠50只，体重130～150 g;4～6周龄，由安徽医科大学动物中心提供。随机将其分为对照组(A)、哮喘组(B)、地塞米松组(C)低剂量LPS组(D1)及高剂量LPS组(D2)共5组，每组10只。

1.2 实验方法

1.2.1 SD大鼠哮喘模型建立、样品的留取与保存

1.2.1.1 动物模型的复制:B组大鼠第1、第8天予以OVA/Al(OH)3混合液1 ml［含 Al(OH)3100 mg和OVA 1 mg］腹腔注射致敏，第15天予以1%OVA雾化激发30 min，持续3 d。A组以0.9%氯化钠溶液代替OVA进行致敏与激发。C组:待腹腔注射1 ml含100 μg地塞米松1 h后在致敏和激发。D1组、D2组在致敏阶段每隔2 d 予以 1 ml含 0.1 μg、100 μg E.coil LPS腹腔注射，激发阶段待每次予以相同剂量浓度E.coil LPS腹腔注射1 h后在进行激发。

1.2.1.2 样品的留取与保存:末次激发后1 d，腹腔注射麻醉采用10%水合氯醛溶液400 mg/kg，打开腹腔，腹主动脉取血，离心 10 min，3 000 r/min，吸取血清，－80℃储存备用。胸腔打开，肺组织分离，左主支气管结扎，右肺经气管行灌洗，分4次注入10 ml0.9%氯化钠溶液，轻轻按摩肺组织，30 s后回收灌洗液，回收率超过80%，然后离心10 min，3 000 r/min，取上清－80℃储存备用。细胞沉淀用于细胞总数与分类计数。左肺近肺门组织切取，4%多聚甲醛固定，原位杂交标本固定2～3 h，HE染色和细胞凋亡检测标本固定5～6 h后，转入70%乙醇，常规石蜡包埋切片［2］。

1.2.2 试验方法:通过光镜观察肺组织病理变化及支气管肺泡灌洗液(Bronchoalveolar lavage fluid，BALF)中嗜酸性粒细胞(Eosinophils，EOS)计数，酶联免疫吸附试验、原位杂交法及末端脱氧核苷酰基转移酶介导性dUTP切口末端标记法(Terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick end，TUNEL)对各组大鼠肺组织TLR4mRNA表达，血清OVA-sIgE含量及EOS凋亡进行检测。

1.3 统计学分析 应用SPSS 17.0统计软件，计量资料以表示，采用方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 对哮喘大鼠肺组织的病理变化 高倍镜下观察HE染色肺组织切片，A组肺间质视野清晰，肺组织形态良好，可见肺泡管、小支气管，未见明显炎症细胞浸润。B组肺间质及肺泡腔内、支气管及血管周围大量炎症细胞浸润，支气管黏膜下水肿，黏膜皱褶增多，粘液腺增生。与B组比较，C组和D2组上述现象明显减轻，D1组无明显变化。见图1～5。

图1 A组大鼠肺组织无炎症细胞浸润(光镜×200)

图2 B组大鼠肺组织炎症细胞浸润(光镜×200)

图3 C组大鼠肺组织少量炎症细胞浸润(光镜×200)

图4 D1组大鼠肺组织炎症细胞浸润(光镜×200)

图5 D2组大鼠肺组织少量炎症细胞浸润(光镜×200)

2.2 对哮喘大鼠炎性细胞的改变 BALF中细胞总数、EOS计数及EOS百分比:B组均明显高于A组(P＜0.01);C组和D2组均明显低于B组(P＜0.01);D1组与B组均差异无统计学意义(P＞0.05)。见表1。

表1 5组大鼠BALF中细胞总数、EOS计数及EOS百分比比较±s

表1 5组大鼠BALF中细胞总数、EOS计数及EOS百分比比较±s

注:与 B 组比较，*P ＜0.01

组别 细胞总数(×109/L) EOS计数(×107/L) EOS百分比(%)A 组 2.00 ±0.11* 1.13 ±0.16* 0.56 ±0.05*B 组 4.28 ±0.08 34.43 ±1.42 8.03 ±0.19 C 组 2.41 ±0.04* 4.84 ±0.49* 2.01 ±0.18*D1 组 4.33 ±0.07 34.59 ±0.76 7.99 ±0.08 D2 组 2.31 ±0.05* 4.33 ±0.67* 1.87 ±0.25*

2.3 对哮喘大鼠OVA-sIgE含量的影响 OVA-sIgE含量:C组、D2组与A相比有明显差异(P＜0.01)，但较B组有明显降低(P＜0.01)。D1组与B组比较无统计学差异(P＞0.05)。见表2。

表2 5组大鼠血清OVA-sIgE含量比较μg/ml，±s

表2 5组大鼠血清OVA-sIgE含量比较μg/ml，±s

注:与 B 组比较，*P ＜0.01;与 A 组比较，#P ＜0.01

组别OVA-sIgE A 组 14.72 ±1.69*B 组 82.33 ±2.93 C 组 44.62 ±2.72*#D1 组 84.38 ±2.31 D2 组 42.12 ±2.90*#

2.4 对哮喘大鼠肺组织TLR4mRNA表达及EOS凋亡的影响 TLR4mRNA表达能力:A组与B组差异无统计学意义(P＞0.05);C组、D1组、D2组均明显高于B组(P＜0.01);D1组明显低于 D2组(P＜0.01)。EOS凋亡率:B组和D1组有少许核深染为棕褐色的凋亡细胞。A组、C组、D2组较B组增多(P＜0.05 或 ＜0.01)。见表3、4。

表3 5组大鼠TLR4mRNA表达比较±s

表3 5组大鼠TLR4mRNA表达比较±s

注:与 B 比较，*P ＜0.01;与D1 组比较，#P ＜0.01;与 C 组比较，△P ＜0.01

组别 TLR4mRNA(A值)A组24.60 ±0.48 B 组 25.74 ±1.75 C 组 34.38 ±1.48*D1 组 29.44 ±2.27*D2 组 39.18 ±1.30*#△

表4 5组大鼠肺组织EOS凋亡率比较%，±s

表4 5组大鼠肺组织EOS凋亡率比较%，±s

注:与 B 组比较，*P ＜0.05，#P ＜0.05;与 C 组比较，△P ＜0.01

组别 EOS 凋亡率A 组 8.86 ±0.72*B 组 7.13 ±0.98 C 组 13.34 ±0.61#D1 组 7.14 ±0.64 D2 组 14.66 ±0.85#△

3 讨论

哮喘是威胁公共健康常见的一种慢性肺部疾病，多种炎性细胞浸润是其的一种重要特征［3］。郑燕妮等［4］表明脂多糖来源的髓源抑制性细胞可能通过抑制Th2过度免疫应答和上调小鼠外周血Treg细胞比例，从而减轻哮喘小鼠气道炎症。LPS浓度对Th1/Th2炎症反应具有一定的影响。低剂量LPS可增强Th2敏感性，高剂量LPS可增强Th1反应，表在过敏性炎症反应中LPS具有独特的双向作用［5］。本文通过高倍镜来观察HE染色肺组织切片，结果A组肺间质视野清晰，肺组织形态良好，可见肺泡管、小支气管，未见明显炎症细胞浸润。B组肺间质及肺泡腔内、支气管及血管周围大量炎性细胞浸润，支气管黏膜下水肿，粘膜皱褶增多，粘液腺增生。与B组比较，C组和D2组上述现象明显减轻，D1组无明显变化。本文又通过对BALF中炎症细胞总数及分类计数，结果B组均明显高于A组(P＜0.01);C组和D2组均明显低于B组(P＜0.01);D1组与B组均差异无统计学意义(P＞0.05)。研究说明地塞米松和高剂量LPS能缓解哮喘大鼠气道炎性细胞浸润，而低剂量LPS无此功能。该结果与肺组织病理改变相符。

人群调查表明IgE水平升高与哮喘的增加相关，IgE水平的升高会导致气道黏膜水肿、气道平滑肌痉挛、粘液分泌亢进，从而诱发气道高反应性［6］。Rodriguez等［7］表明，LPS 通过活化 TLR4，可激活天然免疫，抑制致敏小鼠IgE介导的变态反应、EOS募集、肺内炎症、粘液分泌增多及气道高反应性。本文通过ELISA法检测大鼠血清OVA-sIgE水平，结果C组、D2组与A相比有明显差异(P＜0.01)，但较B组有明显降低(P＜0.01)。D1组与B组比较无统计学差异(P＞0.05)。本研究表明哮喘组大鼠特异性IgE抗体水平较明显升高，这与哮喘的特征相一致。高剂量LPS可降低血清OVA-sIgE水平，而低剂量LPS对血清OVA-sIgE水平无影响，进一步证实LPS对哮喘的影响具有剂量相关性。

动物实验表明，小剂量LPS小鼠模型可使支气管肺泡灌洗液中嗜酸性粒细胞增多，Th2免疫反应增强，而对照小鼠及TLR4基因缺陷小鼠，却无Th2免疫反应增强［8］。结果说明，Th2应答需TLR4信号，在机体向Th2免疫反应发展中TLR4有着重要的作用。李鸿佳等［9］研究表明低剂量 LPS(0.1 mg/L)诱导哮喘小鼠AM的TLR4高表达，使肺部炎症加重，而高剂量LPS(100 mg/L)可能会减轻变态反应症状。本研究中，TLR4mRNA的细胞胞浆着色呈棕黄色，主要表达于平滑肌细胞，肺巨噬细胞，支气管上皮细胞及EOS等。C组、D1组、D2组均明显高于B组(P＜0.01);D1组明显低于D2组(P＜0.01)。本研究表明，在免疫系统中TLR4对LPS反应有着重要的作用，LPS能诱导哮喘大鼠肺组织TLR4mRNA表达的上调。低剂量LPS与高剂量LPS均能提高TLR4mRNA表达能力，且随LPS浓度的增高TLR4mRNA表达逐渐增加，而单纯OVA不能刺激TLR4 mRNA表达增强。

嗜酸性粒细胞(Eosinophils，EOS)是哮喘发病机制中主要效应细胞，诱导哮喘患者EOS的凋亡可缓解哮喘病情的严重程度，且不会因细胞死亡而发生局部炎症反应［10］。本研究中，B组和D1组有少许核深染为棕褐色的凋亡细胞。A组、C组、D2组较B组增多(P＜0.05或＜0.01)。研究说明LPS影响哮喘发展的机制与诱导EOS凋亡有关。

综上所述，高剂量脂多糖能降低血清中OVA-sIgE水平，上调TLR4表达，诱导哮喘大鼠肺组织EOS凋亡;低剂量脂多糖虽激活TLR4信号通路，却不能缓解哮喘的气道炎症。可见，对哮喘大鼠使用高剂量LPS进行干预，在哮喘的防治中，可达到地塞米松的治疗效果。

1 谷元廷，吴河水，徐建波，等.全肝缺血再灌注小鼠肺泡巨噬细胞Toll样受体2/4的表达.郑州大学学报:医学版，2006，41:1047-1049.

2 Celedon JC，Milton DK，Ramsey CD，et al.Exposure to dust mite allergen and endotoxin in early life and asthma and atopy in childhood.Allergy Clin Immunol，2007，120:144-149.

3 Shi L，Wang JS，Liu XM，et al.Upregulated functional expression of Toll like receptor 4 in mesenchymal stem cells induced by lipopolysaccharide.Chin Med J(Enql)，2007，120:1685-1688.

4 郑燕妮，于化鹏，陈新，等.脂多糖诱导髓源抑制性细胞对哮喘小鼠气道炎症的影响及其机制.中华医学杂志，2012，92:3147-3150.

5 Hemelaers L，Louis R.Eotaxin:a important chemokine in asthma.Re Med Liege，2006，61:223-226.

6 杨玲，许以平，曹玲仙，等.不同浓度肽聚糖、脂多糖、聚肌胞苷酸对过敏性支气管哮喘患者嗜碱性粒细胞释放能力的作用.上海医学，2008，31:853-855.

7 Rodriguez D，Keller AC，Faquim-Mauro EL，et al.Bacterial lipopolysaccharide signaling through Toll-like receptor 4 suppresses asthma-like responses via nitric oxide synthase 2 activity.J Immunol，2003，171:1001-1008.

8 Eswarappa SM，Basu N，Joy O，et al.Folimycin(concanamycin A)inhibits LPS-induced nitric oxide production and reduces surface localization of TLR4 in murine macrophages.Innate Immun，2008，14:13-24.

9 李鸿佳，王淑娟，李艳丽，等.不同剂量脂多糖预处理对哮喘小鼠肺部炎症的影响的研究.细胞与分子免疫学杂志，2008，24:1008-1010.

10 Hemelaers L，Louis R.Eotaxin:a important chemokine in asthma.Re Med Liege，2006，61:223-226.