正交试验优选超声提取芦笋总皂苷的工艺

揭 晶，王 皓，蔡由生

(武汉生物工程学院 制药工程系，湖北 武汉 430415)

芦笋(Asparagusofficinalis)，又名石刁柏，系百合科天门冬属多年生宿根性草本植物，是世界十大名菜之一，质地鲜嫩，风味独特、柔嫩爽口，在国际上享有“蔬菜之王”的美称[1-3]。现代研究表明其主要成分为甾体皂苷类，具有较强的生理和药理活性，包括抗肿瘤、降血脂、抗衰老、抗疲劳、免疫调节等作用[4-7]。

芦笋总皂苷的提取，目前较为常用的方法是浸提法[8-9]，该法提取时间长、操作繁琐。超声提取技术作为一种中药提取的新技术，具有省时、高效、能耗低等优点，其在中药提取工艺中的应用越来越受到关注。本研究以提取率为评价指标，采用单因素实验和正交试验优选芦笋总皂苷的最佳提取工艺，旨在为其进一步研究提供依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器

HN22-600C型超声波清洗机(上海汗诺仪器有限公司)，HHS4S型电子恒温不锈钢水浴锅(上海光地仪器设备有限公司)，TU-1810型紫外分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司)，ZBY-26型商用制冰机(江苏白雪电器股份有限公司)，BS124S型电子天平(北京赛多利斯仪器系统有限公司)。

1.2 试药

芦笋(市售，购于武汉新辰食品有限公司)，经本系生药教研室殷丹老师鉴定为石刁柏，切段干燥，粉碎过60 目筛，备用。菝葜皂苷元对照品(由国药集团化学试剂有限公司提供，批号：20100710，纯度98%)，其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 芦笋总皂苷的含量测定

2.1.1 对照品溶液的配制

精密称取菝葜皂苷元对照品5.1 mg，置于10 mL容量瓶中，加甲醇溶解，定容至刻度，摇匀，备用。

2.1.2 最大吸收波长的确定

精密吸取对照品溶液适量，置于10 mL具塞试管中，水浴挥干溶剂，加高氯酸5 mL，摇匀，65 ℃水浴15 min，取出后于冰水浴中冷却5 min，随行空白，在200～500 nm波长范围内扫描，得最大吸收波长为311 nm。

2.1.3 标准曲线的绘制

精密吸取对照品溶液0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 mL，置于10 mL具塞试管中，水浴挥干溶剂，加高氯酸5 mL，摇匀，65 ℃水浴15 min，取出后于冰水浴中冷却5 min，在311 nm处测定吸收度。以菝葜皂苷元质量(μg)为横坐标，吸收度A为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程y=0.002 2x+0.027 7，r=0.999 1，结果表明在102～307 μg范围内呈现良好的线性关系。

2.2 芦笋总皂苷的提取

精密称取2 g芦笋粉末，置于250 mL锥形瓶中，加入一定浓度的乙醇适量，在一定的水浴温度条件下超声提取。然后将粗提液置于500 mL圆底烧瓶中用旋转蒸发仪蒸干，再用甲醇溶解，过滤，于100 mL容量瓶中定容备用。

2.3 单因素实验

2.3.1 乙醇浓度的影响

精密称取2 g芦笋粉末六份，分别加入30 mL 40%、50%、60%、70%、80%、90%乙醇，在50 ℃、600 W、40 kHz条件下超声提取50 min，提取1次，照2.2项下蒸干定容。然后精密吸取样品溶液0.1 mL，置于10 mL具塞试管中，照2.1.3项下测定含量，结果见图1。结果表明，随着乙醇浓度的提高，总皂苷含量逐渐增加，当浓度为70%时，总皂苷含量最高。继续提高乙醇浓度，总皂苷含量反而下降。

图1 乙醇浓度对提取率的影响

2.3.2 料液比的影响

精密称取2 g芦笋粉末六份，分别加入料液比为1∶4、1∶6、1∶8、1∶10、1∶15、1∶20(W/V)70%乙醇，在50 ℃、600 W条件下超声提取50 min，提取一次，照2.2项下蒸干定容。然后精密吸取样品溶液0.1 mL，置于10 mL具塞试管中，照2.1.3项下测定含量，结果见图2。结果表明，随着溶剂量的增加，总皂苷含量逐渐增加，当料液比为1∶15时，总皂苷含量最高，变化趋势较为平稳。

图2 料液比对提取率的影响

2.3.3 超声时间的影响

精密称取2 g芦笋粉末6份，加入30 mL 70%乙醇，在50 ℃、600 W、40 kHz条件下，分别超声提取10、20、30、40、50、60 min，提取1次，照2.2项下蒸干定容。然后精密吸取样品溶液0.1 mL，置于10 mL具塞试管中，照2.1.3项下测定含量，结果见图3。结果表明，随着超声时间的增加，总皂苷含量逐渐增加，当超声时间为50 min时，总皂苷含量最高。继续增加超声时间，总皂苷含量稍有下降。

2.3.4 超声温度的影响

精密称取2 g芦笋粉末五份，加入30 mL 70%乙醇，分别控制超声温度为40、50、60、70、80 ℃，于600 W、40 kHz条件下，超声提取50 min，提取1次，照2.2项下蒸干定容。然后精密吸取样品溶液0.1 mL，置于10 mL具塞试管中，照2.1.3项下测定含量，结果见图4。结果表明，当超声温度为50 ℃时，总皂苷含量最高。继续升高温度，总皂苷含量下降，可能与高温破坏皂苷成分有关。

图3 超声时间对提取率的影响

图4 超声温度对提取率的影响

2.4 正交试验考察

以芦笋总皂苷提取率作为指标，考察乙醇浓度(%)、料液比(W/V)、超声时间(min)、超声温度(℃)的影响，采用L9(34)正交试验设计，优选芦笋总皂苷的提取工艺。正交试验因素水平详见表1，结果及分析见表2、3。

由表2极差可知，各因素对芦笋总皂苷提取率的影响顺序为A>C>B>D，即乙醇浓度>超声时间>料液比>超声温度，同时表3结果表明，乙醇浓度和超声时间对提取率的影响有统计学意义，其中乙醇浓度的影响非常显著。因此芦笋总皂苷超声提取的最佳工艺为A1B3C1D1，即乙醇浓度70%，料液比1∶15(W/V)，超声时间50 min，超声温度40 ℃。

表1 因素水平表

表2 正交试验结果表

续表2

表3 方差分析表

2.5 验证试验

最佳提取条件下，按照“2.2”项下方法，计算芦笋总皂苷提取率。进行了3次重复测定，结果分别为124.5 mg/g、131.7 mg/g、125.9 mg/g，平均提取率为127.4 mg/g，约等于正交试验中的最高提取率，表明通过正交试验研究达到了优化目的。

3 讨 论

芦笋中的甾体皂苷类化合物是抗癌的主要成分，其水解产物是菝葜皂苷元[10]，所以选择菝葜皂苷元作为对照品。由于菝葜皂苷元没有紫外吸收，所以选择高氯酸作为显色剂，间接测定芦笋总皂苷的含量。

前期实验中，还考察了超声频率和提取次数对提取率的影响，结果表明40 kHz比59 kHz条件下的提取率大，第一次的提取率远远高于第二次和第三次，占总提取率的80%，所以单因素考察时，选择提取频率40 kHz，提取1次。由于实验条件所限，超声功率定额600 W，无法进行超声功率的考察，此项有待完善。

参考文献：

[1] 李翠霞，毛箬青，李志忠，等.芦笋营养成分的分析评价[J].现代食品科技，2011，27(10):1260-1263.

[2] 鞠玉栋.芦笋的化学成分及其药理作用[J].中国园艺文摘，2011(2):125-126.

[3] 王春燕，王卫东，李超，等.芦笋的生物活性成分及其生理功能[J].食品与药品，2010，12(9):369-372.

[4] 顾关云，蒋昱.芦笋的化学成分和生物活性[J].国外医药——植物药分册，2007，22(2):47-50.

[5] 宋擎，柴秋彦，张立伟.芦笋总皂苷抗肿瘤作用研究[J].食品科学，2010，31(13):273-275.

[6] 王洁琼，赵頔，冉霞，等.芦笋皂苷的抗肿瘤作用研究进展[J].现代生物医学进展，2011，11(2):393-396.

[7] 季宇彬，许贺.芦笋抗肿瘤活性成分及作用机制的研究进展[J].药品评价，2008，5(9):428-432.

[8] 刘杰.正交实验法优选芦笋茎中总皂苷的提取工艺[J].光明中医，2008，23(11):1672-1676.

[9] 宋佳，钱海峰，张超，等.芦笋老茎中皂苷两种提取工艺的比较[J].食品科技，2011，36(3):193-199.

[10] 孙春艳，赵伯涛，郁志芳，等.芦笋的化学成分及药理作用研究进展[J].中国野生植物资源，2004，23(5):1-5.