超声波法提取野生石蒜中加兰他敏

文祝友，熊海蓉，熊远福，李 霞，蒋利华，赵明明

(1.湖南农业大学 动物科技学院，长沙 4101281； 2.湖南农业大学 分析测试中心，长沙 410128；3.湖南农业大学 理学院，长沙 410128)

石蒜(LycorisHerb.)属于单子叶植物纲石蒜科(Amaryllidaceae)多年生草本植物，全球约20种，我国拥有15个野生种[1-2]，资源丰富。石蒜鳞茎含有加兰他敏、石蒜碱、力可拉敏等多种生物碱，具有重要药用价值[3-4]。加兰他敏(Galanthamine)为具有3个光学活性碳原子的四环叔胺型异喹啉类生物碱[5]，化学名称：11-甲基-3-甲氧基-4α,5,9,10,11,12-六氢-6H-苯并呋喃[3α,3,2-ef][2]苯并氮杂卓-6-醇[6-7]。加兰他敏是一种选择性可逆胆碱酯酶抑制剂，最初用于治疗小儿麻痹后遗症、闭角型青光眼、重症肌无力、术后肠肌麻痹、尿潴留以及作为手术麻醉后的催醒剂[8]；后来临床研究显示：加兰他敏在治疗轻、中度阿尔茨海默病(AD，老年痴呆症)方面毒副作用小，具有较好疗效[9]。加兰他敏的氢溴酸盐作为治疗AD的药物先后在奥地利、美国、欧洲等国家上市[10]。石蒜中加兰他敏的提取普遍使用低级醇[11-12]、氯代乙烷[13]、稀酸[14]等常规溶剂法，存在费时、溶剂耗量大、提取物杂质多等缺点，而目前较先进的超声波辅助溶剂法提取加兰他敏的报道很少[15]。本文以野生石蒜为原料，用乙醇作提取剂，通过单因素实验和正交实验，探索了超声波辅助法从石蒜中提取加兰他敏的方法与工艺条件，并与常规溶剂提取法进行了比较，以期为我国丰富的石蒜资源的高值利用提供参考。

1 材料与仪器

1.1 材料与试剂

野生黄花石蒜鳞茎，2011年6月采自湖南九嶷山，洗净、切片、烘干、粉碎后备用。95%乙醇，食用级，市售。乙腈，色谱纯，天津大茂试剂厂。氯仿等其余试剂均分析纯，国药集团化学试剂有限公司。

1.2 主要仪器

HF-2B超声波循环萃取仪，北京弘祥隆生物技术开发有限公司。Agilent1200高效液相色谱仪，美国安捷伦公司。Heidolph型旋转蒸发仪，德国Heidolph公司。pHS-3C型精密pH计，上海雷磁仪器厂。DZF-6020型真空干燥箱，上海精宏实验设备有限公司。AL204型电子天平，梅特勒-托利多仪器有限公司。

2 实验方法

2.1 提取工艺

准确称取一定质量的石蒜干粉，加入适量的提取剂，置于HF-2B超声波循环萃取仪中，在设定温度下提取一定时间；回收溶剂、浓缩提取液，用适量氨水调节溶液pH值为11，然后用氯仿萃取至提取液无生物碱反应；合并氯仿液并回收溶剂，得到膏状加兰他敏提取物。

2.2 单因素与正交实验

根据笔者前期研究结果[12]，本实验以75%乙醇作为提取剂提取加兰他敏。按照上述提取工艺，分别探讨料液比、超声波功率、提取温度、提取时间和提取次数对石蒜中加兰他敏提取效果的影响。根据单因素实验结果，选取对提取效果的影响较大的4个因素，每因素取3个水平，进行L9(34)正交实验，确定超声波法提取加兰他敏的最佳工艺条件。运用正交设计助手ⅡV3.01软件进行统计分析。

2.3 产率、提取率的测定

提取物用甲醇溶解，用高效液相色谱分析加兰他敏的含量[16]，色谱条件如下：固定相：phenomenex-C18，2.1 mm×250 mm，5 μm；柱温：40 ℃；流动相：乙腈-水(含0.1%TFA，体积比20∶80)；流速1.0 mL·min-1；检测波长290 nm；进样量20 μL。运用外标法定量。

准确称取一定质量的原料W(g)，在设定的提取条件下提取加兰他敏，提取物用甲醇溶解后，高效液相色谱测定加兰他敏的质量为W1(g)。准确称取等量的原料两份，一份用最佳提取条件反复多次提取，直至加兰他敏提尽，测定提取物中加兰他敏总质量为W2(g)；另一份完全按本实验所获得的最佳条件提取，测得提取物中加兰他敏的质量为W3(g)，则加兰他敏的产率、提取率按下式计算：产率=(W1/W)×100%；提取率=(W3/W2)×100%。

3 结果与分析

3.1 加兰他敏提取的单因素实验

3.1.1 超声波功率对加兰他敏提取的影响

由图1可知，随着超声波功率增加，加兰他敏的产率逐渐上升；当功率大于250 W后，加兰他敏产率有所下降，可能是功率过大、导致加兰他敏分解所致。故超声波功率以250 W～300 W为宜。

图1 超声波功率对加兰他敏提取的影响

3.1.2 料液比对加兰他敏提取的影响

由图2可知，随着料液比的增加，加兰他敏的产率开始上升较快；当料液比达到1∶6之后，产率上升幅度很小。从经济效益考虑，料液比以1∶6左右为宜。

图2 料液比对加兰他敏提取的影响

3.1.3 温度对加兰他敏提取的影响

由图3可见，随着提取温度升高，加兰他敏的产率初期上升较快；达到60 ℃时产率最大；继续升温，产率开始下降，可能是温度高致使加兰他敏被氧化所致。实验还发现，温度过高会导致石蒜中的淀粉大量溶出，出现提取液糊化现象、后续分离困难。故温度以60 ℃左右为宜。

图3 温度对加兰他敏提取的影响

3.1.4 时间对加兰他敏提取的影响

由图4可知，随着提取时间延长，加兰他敏产率逐渐升高，但时间超过1.5 h后，产率反而下降，可能是长时间的超声波处理导致部分加兰他敏分解所致。提取时间选1.5 h较适宜。

图4 时间对加兰他敏提取的影响

3.1.5 次数对加兰他敏提取的影响

由图5可知，随着提取次数的增加，加兰他敏产率开始上升较快，但达到2次之后其增幅已不明显。提取次数多费时、且提取剂耗量大，考虑经济因素，提取2次较适宜。

图5 次数对加兰他敏提取的影响

3.2 加兰他敏提取的正交实验

单因素实验结果表明，提取温度(A)、超声波功率(B)、料液比(C)、提取总时间(D)对加兰他敏产率的影响较大。因此，选择这4个因素、每个因素设定3个水平，进行L9(34)正交实验，结果如表1、表2所示。

从表1各因素的极差(R)大小和表2方差分析可知，影响加兰他敏提取效果的因素从主到次依次为：A>D>B>C；其中温度的影响最大，达10%显著水平(a=0.10)。从表1每个因素3个水平的均值(k)大小及表2方差分析可知，最佳提取条件组合为A2B1C2D2，即超声波提取加兰他敏的最佳工艺条件：温度60 ℃、超声波功率250 W、料液比1∶6、时间1.5 h，提取2次。

表1 正交实验结果

表2 正交实验方差分析

3.3 产率、提取率及提取物含量测定结果

按上述最佳工艺条件进行5轮重复提取验证实验，经过HPLC法测得加兰他敏提取率的平均值为94.6 %，加兰他敏产率的平均值为0.0543 %；提取物中加兰他敏含量为15.53 %。加兰他敏标样、提取物色谱图见图6。

图6 加兰他敏标样(A)和提取物(B)的HPLC图谱

3.4 超声波法与常规溶剂法的比较

从表3可知， 与常规溶剂法相比，超声波法提取石蒜中的加兰他敏具有用时少、提取率及产率高、提取次数少等优点，总体效果优于常规溶剂法。

表3 超声波法与常规溶剂法的比较

4 结 论

(1)以乙醇为提取剂，超声波法提取野生石蒜中加兰他敏的最佳工艺条件：料液比1∶6、超声波功率250 W、提取温度60 ℃、提取时间1.5 h，提取2次。在该条件下加兰他敏的提取率达94.6%，加兰他敏产率0.054 3%；提取物中加兰他敏含量为15.53%。

(2)超声波法提取石蒜的中加兰他敏，具有用时少、提取率及产率高、提取次数少等优点，总体效果明显优于常规溶剂。

参考文献：

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