蛋白酶对8～21日龄肉仔鸡生长性能、氨基酸表观消化率及肠道组织形态的影响

周 梁 张海军 王 晶 郑旭阳 齐广海* 武书庚*

我国2012年进口大豆5 838万t，蛋白质原料对外依存度大于80%，使得近年来我国饲料成本居高不下，养殖效益难以保障，动物对饲料营养物质的利用率不足40%。鉴于此，利用蛋白酶提高蛋白质的利用率日益得到重视。研究表明，在当前的原料价格水平下，应用蛋白酶可降低饲料成本，提高畜禽养殖收益［1］。另外，蛋白质利用率的提高还能减少氮的排放，减轻环境污染。市场上常见的蛋白酶制剂主要有复合型和单组分型。复合型蛋白酶制剂以蛋白酶为主要成分，可提高营养物质消化率和肉仔鸡生长性能［2－4］，但较难定义蛋白酶的具体作用。所以，研究单组分型蛋白酶对动物生长性能的影响并评价蛋白酶的作用，得到了学者的认可。近年来，学者对新型丝氨酸蛋白酶［1］的研究较多，该蛋白酶源自诺卡式菌，由地衣芽孢杆菌发酵生产而来，能有效提高动物饲粮中特定氨基酸的消化率，缓解低蛋白质(低氨基酸)饲粮对动物生长速度的影响［2，5］，提高动物对营养物质尤其是蛋白质的消化率［6］。但目前针对此蛋白酶的研究均以低蛋白质饲粮为基础，就其对饲喂正常营养水平饲粮动物的作用效果及其适宜添加水平的研究较少。本试验在实际生产条件下，研究正常营养水平饲粮中不同添加水平的蛋白酶对肉仔鸡生长性能、氨基酸表观消化率及肠道组织形态的影响，为蛋白酶在肉仔鸡生产中的合理应用提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.2 试验设计与基础饲粮

试验选择1日龄爱拔益加(AA)肉仔鸡850只(公母各占1/2)，于环境可控、持续光照的鸡舍内饲养至7日龄，逐只称重，选择体重相近、健康的560只(公母各占1/2)肉仔鸡随机分为5组，每组8个重复，每个重复14只鸡，各组初始体重经检验差异不显著(P＞0.05)。对照组饲喂基础饲粮，试验组分别饲喂在基础饲粮中添加 0.01%、0.02%、0.04%和 0.08%蛋白酶的试验饲粮，试验期14 d。

参照 NRC(1994)、《鸡饲养标准》(NY/T 33—2004)及《中国饲料成分及营养价值表》(2011)，结合《AA肉仔鸡饲养管理手册》配制玉米－豆粕－肉骨粉型基础饲粮(表1)，蒸汽制粒。为方便测定营养物质表观消化率，提高饲粮中盐酸不溶性灰分(AIA)标记物含量，饲粮中添加1.25%的硅藻土(SiO2＞90%)。在配制添加蛋白酶试验饲粮时，以蛋白酶替代等量的硅藻土。

1.3 饲养管理

试验鸡采用4层笼养，自然光照加人工补光，光照强度30 lx。第1周鸡舍温度33～35℃，而后每周降低2～3℃。饲养管理依据《AA肉仔鸡饲养管理手册》进行，常规免疫，自由饮水和采食。

1.4 检测指标及方法

生长性能:每日观察鸡群的生长、发病及死亡状况，记录死淘数。在20日龄的22:00禁食，期间自由饮水，次日08:00，以重复为单位称重、结料。计算平均日增重(ADG)、平均日采食量(ADFI)和料重比(F/G)。

表1 基础饲粮组成及营养水平(风干基础)Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet(air－dry basis) %

粗蛋白质及氨基酸表观消化率:于21日龄随机从每个重复中选取肉仔鸡公、母各1只，颈脱节致死，取回肠(卵黄囊遗迹到回盲结合部的后段2 cm)内容物，冷冻，冻干，研磨，过 0.5 mm 筛，4℃保存。

测定饲粮和回肠食糜中的粗蛋白质、AIA和氨基酸含量。粗蛋白质含量使用KDY－9830型自动凯氏定氮仪测定;AIA含量根据GB/T 23742—2009/ISO5985:2002的方法测定;氨基酸含量(17种)由中国农业科学院畜牧兽医研究所中心分析室测定。粗蛋白质表观消化率(%)=［1－(饲粮中指示剂含量/食糜中指示剂含量)×(食糜中粗蛋白质

含量/饲粮中粗蛋白质含量)］×100;氨基酸表观消化率(%)=［1－(饲粮中指示剂含量/食糜中指示剂含量)×(食糜中氨基酸

含量/饲粮中氨基酸含量)］×100。

肠道组织形态:各段小肠称重，分别将十二指肠、空肠和回肠的近端肠段剪下长3 cm的组织样，用冰冷的生理盐水缓缓冲洗干净，浸入4%福尔马林溶液，4℃保存，以备制作石蜡切片。电镜观测小肠绒毛高度、隐窝深度。

1.5 统计分析

试验数据采用 SPSS 16.0软件的 one－way ANOVA程序统计分析，Duncan氏法进行差异显著性比较，以P＜0.05为差异显著性判断标准。数据以“平均值±标准差”表示。

2 结果

2.1 蛋白酶对肉仔鸡生长性能的影响

由表2可知，随蛋白酶添加水平增加，肉仔鸡的ADG呈先升高后降低的二次曲线关系(P＜0.05)，0.02%蛋白酶组最高，较对照组提高了6.7%(P＜0.05);饲粮添加蛋白酶提高了肉仔鸡的ADFI，各蛋白酶组肉仔鸡ADFI均显著高于对照组(P＜0.05);各组之间 F/G差异不显著(P＞0.05)。

表2 蛋白酶对肉仔鸡生长性能的影响Table 2 Effects of protease on growth performance of broilers

2.2 蛋白酶对肉仔鸡粗蛋白质及氨基酸表观消化率的影响

由表3可知，蛋白酶可二次性提高肉仔鸡对粗蛋白质的表观消化率(P=0.005)，0.02%蛋白酶组较对照组提高了8.7%(P＜0.05);蛋白酶可二次性提高氨基酸(亮氨酸和异亮氨酸除外)的表观消化率(P＜0.05)。

0.01 %和0.02%蛋白酶组甘氨酸的表观消化率较对照组显著提高了 8.8%及 10.6%(P＜0.05)。所有蛋白酶组的蛋氨酸表观消化率及除0.08%蛋白酶组外其他各蛋白酶组的酪氨酸表观消化率均显著高于对照组(P＜0.05)。0.01%和 0.02%蛋白酶组天冬氨酸、苏氨酸、丝氨酸、丙氨酸的表观消化率均显著高于对照组(P＜0.05)。所有蛋白酶组肉仔鸡粗蛋白质和天冬氨酸、苏氨酸、丝氨酸、甘氨酸、丙氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸、酪氨酸、赖氨酸、精氨酸、脯氨酸的表观消化率均呈显著先升高后降低的二次曲线关系(P＜0.05)，其中除酪氨酸、蛋氨酸表观消化率以0.01%蛋白酶组最高外，其余均以0.02%蛋白酶组最高。

表3 蛋白酶对肉仔鸡粗蛋白质和氨基酸表观消化率的影响Table 3 Effects of protease on apparent digestibiliy of crude protein and amino acids of broilers

2.3 蛋白酶对肉仔鸡肠道组织形态的影响

由表5可知，各组之间十二指肠绒毛高度差异不显著(P＞0.05);随蛋白酶添加水平增加，十二指肠隐窝深度呈显著线性升高(P＜0.05)，以0.08%蛋白酶组最深，显著深于除0.04%蛋白酶组外的其他各组(P＜0.05);随蛋白酶添加水平增加，十二指肠绒毛高度/隐窝深度(V/C)呈显著线性降低(P＜0.05)，其中 0.08%蛋白酶组显著低于除0.04%蛋白酶组外的其他各组(P＜0.05)，0.01%、0.02%、0.04%蛋白酶组与对照组无显著差异(P＞0.05)。

空肠形态随蛋白酶添加水平升高，绒毛高度呈二次曲线升高(P＜0.05)，0.01%、0.02%、0.04%蛋白酶组显著高于对照组(P＜0.05)，0.08%蛋白酶组与对照组差异不显著(P＞0.05);隐窝深度呈线性升高(P＜0.05)，0.08%蛋白酶组显著高于对照组(P＜0.05);各组之间 V/C差异不显著(P＞0.05)。

回肠形态方面，各组之间绒毛高度和隐窝深度无显著差异(P＞0.05)，但 0.02%蛋白酶组的 V/C 最高，显著高于 0.04%蛋白酶组(P＜0.05)。

表4 蛋白酶对肉仔鸡肠道组织形态的影响Table 5 Effects of protease on intestinal morphology of broilers

3 讨论

3.1 蛋白酶对肉仔鸡生长性能的影响

本试验表明，在玉米－豆粕－肉骨粉型饲粮中添加蛋白酶，肉仔鸡ADG以0.02%蛋白酶组最高，且有显著先升高后降低的二次曲线关系，与蛋白酶添加水平升高肉仔鸡生长性能呈二次曲线变化的结果［5］相吻合，与玉米－豆粕型饲粮添加复合蛋白酶显著提高肉仔鸡ADG但不影响ADFI的结果［3］不一致。本试验结果显示，蛋白酶能显著提高8～21日龄肉仔鸡的ADFI，可能是因为蛋白酶的添加降低了食糜的黏度而有利于其在肠道的蠕动［7］。另有研究表明，蛋白酶可提高肉仔鸡对低蛋白质饲粮的利用效率［7］，改善低蛋白质对肉仔鸡生长性能造成的影响［2］，且与其他单组分型酶共同使用能有效提高肉仔鸡的ADFI和ADG［8］;单独使用时，也能达到正常蛋白质水平饲粮的饲料效率。然而本试验结果显示，虽然0.02%、0.04%蛋白酶组饲料转化效率较高，但均未显著高于对照组。其主要因可能有2点:1)饲粮类型不同。本试验采用玉米－豆粕－肉骨粉型饲粮，而以往的研究除玉米－豆粕型［2］外，主要成分还涉及小麦［9］、黑小麦［10］和干酒糟及其可溶物(DDGS)［11］等，对于不同的作用底物，蛋白酶作用效果不尽相同。2)试验设计不同。本试验采用正常蛋白质、能量水平的饲粮，与低蛋白质饲粮相比，饲料转化效率的改善效果可能不够明显，具体原因还有待进一步探究。本试验结果提示，饲粮添加0.02%蛋白酶即可改善肉仔鸡生长前期生长性能。

3.2 蛋白酶对肉仔鸡粗蛋白质及氨基酸表观消化率的影响

蛋白酶可提高断奶仔猪的饲粮氨基酸表观消化率［12］，提高生长育肥猪氮的回肠表观消化率［13］，提高肉仔鸡粗蛋白质［2］、能量［14］、氮［15］、淀粉［15］和脂肪酸［10］的表观消化率和真代谢能的利用率［14］。本试验探讨了蛋白酶对粗蛋白质和17种氨基酸的表观消化率，结果表明，正常营养水平的玉米－豆粕－肉骨粉型饲粮中添加不同水平蛋白酶可影响21日龄肉仔鸡粗蛋白质及氨基酸的表观消化率，且整体呈现先升高后降低的二次曲线关系，以0.02%蛋白酶组效果最佳。研究表明，饲用蛋白酶可通过补充内源蛋白酶的不足，并与之协同作用来提高蛋白质利用效率［16］。本试验肉仔鸡氨基酸利用率的提高，可能由于肉仔鸡生长前期的消化系统发育还不够完善，适量添加外源蛋白酶后补充了内源蛋白酶的分泌不足。但当添加超过一定水平后，则可能反馈性的抑制内源蛋白酶分泌，影响消化酶的活性［17］，故本试验中高添加水平的蛋白酶未起到提高营养物质消化率的作用。本试验结果表明，0.01%、0.02%蛋白酶组可提高生长前期肉仔鸡粗蛋白质及氨基酸的表观消化率。

3.3 蛋白酶对肉仔鸡肠道组织形态的影响

家禽小肠绒毛是各种养分吸收的主要场所。小肠绒毛高度与细胞数量相关，绒毛变长则扩大细胞表面积，有利于营养物质吸收;绒毛短时成熟的绒毛细胞减少，对养分的吸收能力降低。隐窝深度反映了细胞增殖率，隐窝变浅表明肠上皮细胞成熟率上升，吸收功能增强。因此V/C可综合反映小肠的功能状态，V/C上升则表示黏膜得到改善，消化吸收功能增强［17］。

研究表明，适量酶制剂能提高肉仔鸡的绒毛高度［18］，但过量则不利于肉仔鸡肠道发育［17，19］。另外饲粮蛋白酶可改善球虫感染肉仔鸡肠道黏液层厚度，影响肠壁形态［20］，且与木聚糖酶共同使用可降低回肠相对长度［9］。本试验表明，饲粮中添加0.08%蛋白酶显著提高了21日龄肉仔鸡空肠隐窝深度，降低了V/C，提示高添加水平蛋白酶不利于生长前期肉仔鸡肠道的发育。0.02%蛋白酶组肉仔鸡十二指肠、空肠和回肠的V/C均最高，且空肠的绒毛高度极显著高于对照组，空肠和回肠的隐窝深度显著低于对照组，可见，饲粮适宜添加水平蛋白酶有利于改善肉仔鸡肠道组织形态，提高肠道消化吸收效率。综合肠道组织形态结果可知，蛋白酶可二次性提高肉仔鸡生长前期的ADG，与适量蛋白酶改善肉仔鸡的肠道组织形态有关;高添加水平蛋白酶对肉仔鸡前期生长不利，与肠道形态发育不佳一致，也可能与蛋白酶活性降低［17］有关，但具体的确切作用机制尚需进一步研究。

4 结论

①玉米－豆粕－肉骨粉型基础饲粮中添加蛋白酶能显著提高肉仔鸡生长前期ADFI，提高肉仔鸡粗蛋白质及氨基酸的表观消化率，

②0.02%蛋白酶组有利于肉仔鸡肠道组织发育，0.08%蛋白酶组则不利于肉仔鸡肠道组织发育。

③本试验条件下，蛋白酶的适宜添加水平为0.02%。

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