米非司酮对大鼠增生型子宫内膜中Fas／FasL表达的影响

王宜芹 侯 晓 滕怀香

1.山东省日照市计划生育科研所（276826）；2.山东省济南市计划生育服务中心

子宫内膜增生症是功能失调性子宫出血（简称功血）最常见的一种病理类型，属异常子宫出血的范畴。是由于调节生殖的神经内分泌机制失调而引起的异常子宫出血，而全身及内外生殖器并无器质性病变存在。本病的临床表现有不规则的子宫出血，导致不同程度的贫血甚至休克。治疗原则是止血，调整月经周期或诱导闭经改善全身症状。目前对功血的治疗主要分为药物治疗和手术治疗两类［1］。近几年米非司酮因其能拮抗雌孕激素，负面影响卵泡发育、延迟排卵，诱导黄体溶解，抑制子宫内膜增生等作用被广泛应用于功血的治疗，尤其是围绝经期功血。本研究成功建立子宫内膜增生症的大鼠模型，通过观察大鼠子宫内膜组织中凋亡调控蛋白Fas／FasL的表达情况，从细胞凋亡角度进一步探讨米非司酮治疗功血的作用机理。

1 材料与方法

1.1 实验动物

健康成年SD雌性大鼠49只，体重220±20g，由山东大学实验动物中心提供，合格证号SCXK（鲁）20090001。

1.2 药物与试剂

米非司酮片，北京紫竹药业有限公司生产（批号：1212088）；苯甲酸雌二醇注射液，宁波市三生药业有限公司（批号：130101）；注射用青霉素钠，山东省鲁抗药业股份有限公司（批号：L121018）；生理盐水，山东威高药业有限公司（批号：212100401）；10%水合氯醛，山东大学齐鲁医院（批号：20130502）；Fas免疫组化试剂盒、FasL免疫组化试剂盒均购自北京中杉金桥生物有限公司。

1.3 大鼠子宫内膜增生模型制备

大鼠经过适应性饲养1周后，随机抽取15只作为正常组，另外34只均按照文献［2］中“雌激素负荷法”进行造模。模型组仅行开关腹手术，其余大鼠均行手术摘除双侧卵巢，术后常规护理，肌注青霉素每次16×104U／ml，2次／d，共3d。术后第4天起肌内注射经稀释的苯甲酸雌二醇15μg／100g，隔日一次，共4周。随机抽取4只造模大鼠处死，取出子宫内膜送病理检测，经证实为子宫内膜增生症表示造模成功，方可进行后续实验。

1.4 动物分组、给药及取材方法

将造模后的30只大鼠按照完全随机法分为米非司酮组和模型组，每组15只，其中米非司酮组予以米非司酮混悬液灌胃，连续2周。正常组和模型组大鼠予等容量生理盐水灌胃，日一次，连续2周。末次给药后禁食12h，处死大鼠，摘取子宫，称重后将标本放入4%多聚甲醛固定以备免疫组化实用。

1.5 指标检测及结果判定

采用免疫组化链霉菌抗生物素蛋白－过氧化物酶连结法（S－P法）检测指标Fas和FasL，严格按照试剂盒说明书进行操作，免疫组织化学显示，细胞浆或细胞核上有棕黄色颗粒沉着视为阳性反应。采用Image Plus Pro图像处理分析系统，每例标本选取3张切片，每张切片均采用双盲法随机观察5个不重复的高倍视野（×200），分别测量各组大鼠内膜中阳性部位的灰度值。取其平均值，即代表各指标蛋白表达的相对量，以便半定量分析，灰度值越高蛋白表达水平越低，相反灰度值越低，蛋白表达水平越高。

1.6 统计学方法

采用SPSS19.0统计软件对实验数据进行统计学分析，计量资料应用方差分析以¯x±s表示，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠子宫重量及子宫系数比较

在造模前，49只大鼠的体重均在（220±20）g，组间比较无差异。造模后子宫重量明显增加，模型组与正常组比较差异有统计学意义（P＜0.01）。应用米非司酮干预后子宫重量有所减轻，与模型组比较差异有统计学意义（P＜0.05），但仍较正常组明显增加，组间比较差异显著（P＜0.05）。子宫系数的变化与子宫湿重基本一致。见表1。

表1 各组大鼠子宫重量及子宫系数比较

表1 各组大鼠子宫重量及子宫系数比较

与正常组比较＊P＜0.05 ＊＊P＜0.01；与模型组比较＃P＜0.05＃ ＃P＜0.01；与米非司酮组比较▲P＜0.05

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2.2 各组大鼠子宫组织中Fas和FasL蛋白的表达

免疫组织化学显示，Fas蛋白主要位于间质细胞、腺上皮细胞的细胞浆内，部分于细胞核上。FasL蛋白主要位于间质细胞、腺上皮细胞的细胞核。Fas蛋白在各组中表达的灰度值：正常组（116.63±16.94）＜米非司酮组（130.28±20.66）＜模型组（146.90±24.12），除米非司酮组与正常组比较差异无统计学意义外，各组间差异均有统计学意义（P均＜0.05）。FasL蛋白在各组中表达的灰度值：模型组（122.77±28.10）＜米非司酮组（132.50±27.97）＜正常组（149.75±29.53），其中模型组与正常组比较灰度值明显降低（P＜0.01），说明蛋白的表达较正常组高。米非司酮组与其他组比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。见图1。

图1 各组大鼠子宫组织中Fas／FasL蛋白的表达（SP×200）

3 讨论

功血是由下丘脑－垂体－卵巢轴功能失调引起而非生殖器器质性病灶或全身疾病所引起的不正常子宫出血症，是常见的妇科疾病，属中医的“崩漏”范畴。功血发病机制复杂，至今尚未明了［3］。近年来，细胞凋亡与功血的关系受到许多专家及学者的重视，研究较多的凋亡调节蛋白有 Bcl－2／Bax、Fas／FasL、Survivin等［4］。Fas抗原属于神经生长因子／肿瘤坏死因子受体超家族的成员之一，FasL是Fas抗原的配体，属于肿瘤坏死因子（TNF）家族，两者结合可导致细胞调亡。Fas／FasL系统参与子宫内膜增生过长的形成，Fas及FasL蛋白在正常子宫内膜中的生理性表达［5］，有利于维持细胞增殖和细胞凋亡平衡，在调节正常内膜组织的增殖平衡与结构再建中起到至关重要的作用。功能正常时，Fas蛋白通过诱导内膜细胞凋亡而发挥抑制疾病发生的作用，一旦Fas信号失活会出现细胞凋亡下调、异常细胞生存繁殖，最终导致子宫内膜增生症的发生［6］。本研究在“雌激素负荷法”成功建立大鼠子宫内膜增生症模型基础上，通过模型组与正常组中各指标的变化发现，Fas蛋白在子宫内膜增生症大鼠体内的表达水平明显低于正常大鼠。FasL蛋白的表达高于正常子宫内膜，这一结果与国内外学者的研究相一致。这也进一步说明了子宫内膜增生症中FasL蛋白表达增高和Fas蛋白的低表达，可导致局部细胞凋亡受到抑制，细胞增殖相对增多，影响了子宫内膜的平衡与结构再建，最终促进了疾病的发生、发展［7］。

近几年，米非司酮被广泛应用于功血，尤其是绝经过渡期功血的治疗中。米非司酮在卵泡早期可直接抑制卵泡发育，在中期除直接作用于卵巢外，还能抑制卵泡刺激素和黄体生成素的分泌而抑制卵泡的发育，也可直接作用于卵泡颗粒细胞，促进其凋亡，增加闭锁卵泡数，因此导致卵巢残存卵泡衰萎，造成闭经［8］。另外，米非司酮可使子宫内膜腺上皮细胞出现明显凋亡，抑制内膜腺上皮增生［9］。同时米非司酮在对抗孕激素作用的同时也在某种程度上拮抗雌激素致子宫内膜增生的作用，使基质致密度增加，子宫内膜腺体减少，从而使子宫内膜明显变薄［10］。本研究中米非司酮组大鼠子宫重量及系数均较模型组明显降低，Fas蛋白的表达较模型组有明显提高，这也进一步印证米非司酮有促进子宫内膜增生细胞凋亡的作用，以上结论为将来深入研究功血的发病机制及治疗措施提供了一个新的思路。由于条件限制，实验未对相关指标进行完全定量分析，米非司酮对子宫内膜的促凋亡机制尚待日后进一步系统的研究。

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