刃天青-酵母混合试剂快速鉴定小麦种子活力研究

刘春香, 胡 畔, 张君玉, 赵华恬

(潍坊学院 山东省高校生物化学与分子生物学重点实验室, 山东 潍坊 261061)

小麦是一种在世界各地广泛种植的禾本科植物，是世界上总产量第二的粮食作物，仅次于玉米。目前，我国耕地面积难以增加，而人口日益增长，粮食的稳产高产显得尤为重要。良种是提高作物产量及生产率的最经济有效的措施，且小麦的精密播种机械大量使用[1],人工操作日渐减少，这就要求优良小麦品种要具有高活力，以确保田间整齐出苗，减少人工间苗和补苗，保障粮食稳产。种子活力是确保在广泛的田间条件下能够出苗，并长成健壮幼苗的重要指标[2]。有效的活力测定方法比种子标准发芽率更能说明种子质量的优劣[3-4]。

虽然国际上有许多测定种子活力的方法[5]，各有其优缺点。依赖发芽的检测方法消耗时间长，快速测定如电导率测定[2]、TTC 定量测定、丙二醛含量测定等活力检测方法受条件约束，有的检测复杂，重现性不好，有些效果不稳定。因此有必要探索一种快速可靠的方法，用来快速、无损伤地测定小麦种子活力。Tai Gi Min等[6-7]发明的刃天青显色法，简单、快速、可靠，已经应用于十字花科植物种子活力的检验。刃天青的钠盐溶液为蓝色，有轻微毒性，是一种氧化还原酶指示剂，可被还原而褪色，在食品研究中广泛用来检查需氧细菌的含量，在缺氧环境下由蓝色变为粉色，最终变为无色[8]。最近的研究还发现刃天青可以检测细胞增殖、细胞活力和细菌数量及对辐射的耐受性[9-11]。

种子在衰老过程中其活力不可避免地会有不同程度的下降。衰老主要表现为氧化损伤和细胞膜损伤。膜损伤导致种子内含物如可溶性糖、氨基酸和电解质外渗。电导率测定活力就是基于膜损伤的原理，种子中渗漏的各种物质的量和种子活力的损失程度是成正相关的[12-13]，然而用电导率测定结果不够敏感。本研究主要探讨刃天青显色法是否可以快速、准确地进行小麦种子活力的检测。

1 材料与方法

1.1 种子老化方法

在种子老化箱中采用41℃、相对湿度为90%的人工老化方法处理小麦原种53646种子，分别处理0、3、6 d，老化后室内自然干燥后使用。

1.2 标准发芽实验

随机分别各取3份老化0、3、6 d的小麦种子，按照标准发芽实验条件进行，3次重复，每天观察记载发芽情况，第8天末次计数后对幼苗称量，按照文献[2]的方法计算发芽指数和活力指数。

1.3 刃天青-酵母混合试剂的配制

将蒸馏水调节至pH值7.0，预热至30 ℃，用电子天平称取刃天青钠(购自上海生工生物技术公司)试剂0.002 5 g于1 mL离心管中，加入1 mL蒸馏水溶解制成原液，移入容量瓶定容至25 mL；用电子天平称取干酵母0.025 g于1 mL离心管中，并加入1 mL蒸馏水溶解制成原液，移入容量瓶定容至25 mL；将两种试剂混合均匀(该试剂需要现配现用)成刃天青-酵母混合试剂(以下简称刃天青溶液)。

1.4 显色条件的探索与显色后种子处理

将配置好的刃天青溶液用移液器注入平底带盖96-孔板，第1批每孔注入180 μL，第2批每孔注入160 μL；然后用镊子选取均匀完好的小麦种子放入板孔中，并且保证刃天青溶液完全浸没种子。小麦种子在孔板中的分布为：老化0 d(未经老化处理)位于1—4列，老化3 d位于5—8列，老化6 d位于9—12列，每列8行，每个样品32个孔。将恒温培养箱温度设置为35 ℃，共做3个时间处理，分别用刃天青溶液浸泡5 h、5.5 h、6 h，每处理一个96孔板。

保温浸泡到时间后，取出96孔板，按顺序取出小麦种子，将96孔板迅速放入伯乐model680型酶标仪内于570 nm进行吸光度测定，并拍照。先在发芽纸上用铅笔标出板孔位置号，将每个位置的小麦种子用清水漂洗后放入发芽盒相应位置，按标准发芽实验方法进行发芽，每天观察记载，至第8 d末次计数完。

1.5 统计分析

用Excel进行数据整理，并用其中的函数计算相关系数，对标准发芽实验参照文献[14]的方法做多重比较计算。

2 结果与分析

2.1 刃天青溶液与乙醇和葡萄糖的显色反应

呼吸代谢的底物为葡萄糖，酒精是无氧呼吸的一种产物。为确定种子是否有外渗有机物参与酵母无氧呼吸和变色反应，本研究用不同浓度的乙醇和葡萄糖进行了显色反应。从图1可以看出：蓝紫色的刃天青溶液在体积分数为5%～0.01%的乙醇中作用2 h后，溶液基本会呈现浅粉色，且这一显色反应在0.05%的低浓度下完全可以发生；在0.5～0.000 1 mol/L浓度范围的葡萄糖溶液中刃天青溶液都变成粉色，浓度较低时显略带浅蓝的粉色，较高时为粉色。乙醇、葡萄糖等有机物是使刃天青溶液发生反应变成蓝粉色、粉色或浅粉色的物质基础。

图1 刃天青溶液中添加乙醇、葡萄糖反应2 h后的变色情况

2.2 标准发芽实验的种子活力分析

种子活力可以通过发芽实验后的发芽指数、活力指数等进行度量。通过老化处理后小麦种子的标准发芽实验结果见表1，由表1可见老化3 d种子的发芽率并未显著下降，但活力指数显著下降，老化种子的活力明显低于未老化种子，老化6 d的种子的全部指标显著低于对照。

表1 不同老化处理小麦种子的活力状况

注：同一列中，相同字母表示5%水平差异不显著，不同字母代表5%水平差异显著。

2.3 刃天青溶液的适当体积

从标准发芽实验可知，老化3 d的种子活力显著低于未老化的种子。从图2可以看出，老化0、3、6 d的小麦种子在180 μL刃天青溶液里的板孔都呈现较深的蓝色，变粉色和无色的板孔数量较少，与种子对应的发芽率相关度不高；而在160 μL刃天青溶液里，未经老化处理的种子所在板孔较多，老化3 d、6 d的种子所在板孔呈粉红色、浅蓝色比例明显增加，与表1得出的种子活力参数相关性显著。因此，160 μL是适宜的显色体积，过小的显色体积不能浸没小麦种子。

图2 浸泡保温5.5 h的180 μL刃天青溶液和160 μL刃天青溶液的比较

2.4 刃天青溶液的适宜保温浸泡时间

随着种子在刃天青溶液中保温浸泡时间的延长，种子内含物外渗的量逐渐增加。图3显示，保温浸泡时间过短(5 h)，各个处理间差异不够明显，低活力种子蓝色比例过高；保温时间过长(6 h以上)，活力高与活力低的种子蓝色都变浅、开始变粉，甚至无色，老化0、3、6 d的小麦种子差异不明显。因此5.5 h(见图2(b))是适宜的保温时间，在此温度下，高活力种子普遍呈蓝色，低活力种子多数呈粉色或无色；而小于5.5 h时虽然各处理间通过吸光度值可以显示出差异，但肉眼观察辨别难度较大。

图3 浸泡保温5 h和6 h的比较

2.5 经种子浸泡后刃天青溶液的平均吸光度与种子活力的关系

用刃天青溶液浸泡老化小麦种子后溶液的平均吸光度与浸泡时间关系曲线见图4。

图4 不同老化处理时间刃天青溶液在570 nm的平均吸光度变化曲线

高活力种子与低活力种子相比，细胞膜损伤普遍较小，但都会随种子吸胀时间(即保温浸泡时间)的延长，渗漏物质增加。从图4可以看出，在刃天青溶液中，小麦种子随着35 ℃下吸胀时间的延长，渗漏物质增加，从而使刃天青溶液在570 nm的吸光度下降，无论未老化还是老化的种子都有这一趋势；未老化的高活力种子平均吸光度明显高于老化3、6 d的低活力种子，吸胀5～6 h的3组数据中都显示这一特点，说明种子渗漏物质与不同老化处理间存在显著的差异，通过这一差异可以反映种子活力的高低。

经刃天青溶液浸泡处理的种子在570 nm处的吸光度与发芽率和活力指数的相关关系见表2(表2中R为相关系数)。每粒种子经过刃天青溶液浸泡后都会发生颜色变化，用570 nm的吸光度值可以将颜色变化以数据的形式表现出来。由表2的数据可知，无论将保温5 h、5.5 h还是6 h，经过刃天青溶液浸泡后的小麦种子再做发芽实验，其发芽率与对应的板孔中溶液平均吸光度均呈极显著正相关，说明同一区域板孔颜色的均值可以反映种子活力水平的高低。将刃天青溶液平均吸光度与小麦种子经过标准发芽实验计算的发芽指数、活力指数进行比较分析发现，浸泡5.5 h和6 h的平均吸光度均与发芽指数和活力指数呈显著正相关，但浸泡时间过短，相关性不显著。说明以平均吸光度反映种子活力，且5.5 h、6 h均为适宜的反应时间。

表2 刃天青溶液的平均吸光度与种子发芽率和活力间的指数相关关系

注：*表示显著相关，**表示极显著相关。

2.6 不同活力种子与刃天青溶液颜色的关系

颜色可以通过肉眼观察，不必动用仪器设备，通过颜色变化来衡量种子活力高低是一种简便的方法。种子在刃天青溶液中经过一段时间的保温浸泡后，颜色均发生了不同程度的变化。对呈蓝色的板孔数与对应区域的种子发芽率，以及标准发芽实验各处理种子的标准发芽率、发芽指数、活力指数做相关分析，其相关系数见表3。保温浸泡5 h和5.5 h的蓝色板孔数与其对应区域的发芽率呈显著正相关，且保温5.5 h的相关性达到极显著水平，说明5.5 h为最佳保温浸泡时间，通过蓝色孔数多少可以反映其发芽率的高低；由标准发芽实验得到的种子发芽指数和活力指数均与5.5 h蓝色板孔数呈显著正相关。综合以上结果可知，通过反应5.5 h后的蓝色孔数多少可以反映种子活力的高低，而反应6 h不适宜肉眼观察判断活力大小。

表3 种子质量与刃天青溶液蓝色板孔数的关系

2.7 小麦种子经刃天青溶液浸泡后的发芽情况

小麦种子经刃天青溶液浸泡后的发芽情况见图5—图8。

图5 未老化处理小麦种子浸泡5 h后发芽结果

图6 老化3 d小麦种子浸泡5 h后发芽结果

一般高活力的种子细胞膜修复能力强，多数种子经刃天青显色后均呈蓝色，发芽后幼苗茁壮，如图5和图8左侧所示，图8中有些板孔虽呈现粉紫色，如A3、G3、C2等，这些孔中的小麦虽然多数发芽较好，但籽粒明显变黑，个别不能发芽。老化3 d(图6和图8中部区)板孔颜色和发芽情况的比较可以看出，A6、A7、A8、B6、B7均呈粉色或无色，这些种子最终都没有发芽。老化6 d的C9、G11、B10没有发芽，种皮明显变，板孔颜色较浅，蓝色孔的种子基本能发芽(见图7和图8右侧)。从上面的比较可以看出，种子在板孔中的显色情况说明了种子膜的完好程度，总体上与发芽呈对应关系，也存在少部分不符合的现象。

图7 老化6 d小麦种子浸泡5 h后发芽结果

图8 种子在板孔内的显色情况

2.8 刃天青溶液对小麦种子发芽的毒性分析

从标准发芽实验和浸泡后发芽实验的比较(见图9)可知，未老化的高活力种子发芽率没有受到刃天青溶液的影响，而低活力种子(老化3 d、6 d)发芽率则显著地受到影响，发芽率降低幅度大。另一方面，从小麦种子浸泡后的胚周围颜色可以看出(见图10)，吸胀后活跃的种子胚对刃天青的进入有一定的阻碍作用，渗透较少，而周围的组织则显示了明显的刃天青还原后的颜色(红色)，说明刃天青已经进入了胚周围的组织。图10的第9—12列(老化6 d的种子)可知，其变色总体较浅，说明胚周围组织还原力较弱。以上两方面说明，刃天青对小麦种子有一定的毒性，高活力的种子可以克服其影响，不影响后续发芽，而低活力的种子不能完全克服，发芽率严重下降，种子浸泡后的发芽率也是衡量种子活力高低的重要依据。

图9 小麦种子标准发芽率与浸泡后发芽率的比较

图10 小麦种子经刃天青溶液浸泡6 h后胚周围的变色情况

3 讨论

刃天青溶液颜色变浅、变粉说明从老化了的种子中流出的溶质使刃天青发生反应而减少。那么，能诱发变色反应的溶质是什么呢？种子中渗出的物质不仅有挥发性物质，还有可溶性糖、氨基酸、电解质等多种物质[12]。本研究将葡萄糖和乙醇加入刃天青溶液中，发现两种物质均能使蓝色变为粉色，说明乙醇和葡萄糖都可以诱发变色反应，酵母在其中的作用是利用种子中渗漏的有机物进行呼吸代谢，从而产生还原力。Deborah A 等[8]、Guerin 等[15]认为刃天青在还原力的作用下脱氧产生粉色的物质——试卤灵(rezorufin)，试卤灵继续得到氢和电子可以变成无色化合物(二氢试卤灵)，从而使溶液变成无色。李灵芝等[16]认为小麦浸泡出来的可溶性糖与种子活力密切相关，Kataki P K等[17]认为呼吸代谢的副产物乙醇，其产量是种子质量的指示剂，人工老化可以加速呼吸代谢副产物乙醇的形成[7]，加速种子质量的劣变。

在本实验中也发现，种子在刃天青溶液中浸泡保温6 h后多数孔呈现浅蓝色、浅粉色或无色，说明随着浸泡保温时间的延长，种子中的渗出物质增多，经过酵母的呼吸代谢最终将刃天青还原为二氢试卤灵而失去颜色[8]。因此，浸泡保温时间是关键因素，浸泡保温时间越长，褪色越明显；浸泡保温时间短，则多数种子不变色，因此要筛选适宜的浸泡保温时间以区分不同活力的种子。本研究认为以平均吸光度反映种子活力，5.5～6 h是适宜的浸泡保湿时间，从板孔颜色与发芽率的相关系数和与种子活力的相关系数看，5～5.5 h是适宜的反应时间，从平均吸光度和颜色综合考虑，5.5 h是最佳浸泡时间。Tai Gi Min等[6]则认为4h是萝卜种子的最佳反应时间，可能是不同种子渗出物质的速度和多少有差异导致的。

细胞渗出物质多少与种子活力密切相关，它反映了膜的自我修复能力[4,16]。随着吸胀时间(即浸泡保温时间)的延长，有机物质渗漏到溶液中的量逐渐增加。在同一反应时间，种子渗漏物质快慢即种子细胞膜渗透性大小是反映种子差别的重要因素，有研究认为老化时间越长，细胞膜的损坏越严重，渗出物质越多[18]。本研究依据上述理论进行种子活力的刃天青变色检测。种子发芽与否是综合因素决定的[4]，就单个种子而言，细胞膜渗漏物质多，只是活力差的一种表现，有的种子即使细胞膜通透性较高也能发芽，而有些种子因为内部某种重要因素导致不能发芽，其膜的通透性也有高有低。因此根据单个板孔的颜色判断种子是否发芽有时是不准确的，但多数种子的平均渗漏水平可以反映这批种子的平均活力。本研究的结果证实，通过刃天青溶液的颜色变化比例能够推断小麦种子活力。

老化后低活力的小麦种子经刃天青溶液浸泡后的发芽率与未浸泡的发芽率差异显著，造成这种差异的原因可能是刃天青具有轻微毒性，活力高的未老化种子在发芽过程中能克服其毒性，而活力低的种子则较难克服，一部分种子因此不能发芽。这与Tai Gi Min等[6]认为的刃天青检测对种子无毒是相矛盾的，其原因可能是刃天青毒性较小，且没有与标准发芽实验结果进行比较。是否可以依据这种弱毒性来度量种子活力的高低有待进一步研究，本实验认为刃天青溶液浸泡后的种子发芽率与种子活力高低有相关性。

总之，在严格掌握浸泡条件和时间的基础上，采用96孔板刃天青-酵母试剂鉴定小麦种子活力具有快速、颜色变化简单、无损伤、准确的优点。如果能有吸光度检测仪器，则测定结果更为客观、可靠。

[1] 唐庆海, 赵庆城, 马淑英. 我国机械播种技术与播种机械发展概况与趋势[J]. 河北农业技术师范学院学报, 1994,8(3):59-64.

[2] 颜启传. 种子检验原理和技术[M]. 浙江：浙江大学出版社, 2001.

[3] 埃米尔·扎曼·可汗，哈马永恩·可汗，罗兹纳·可汗, 等. 通过活力测试对小麦种子批质量进行等级区分并预测其田间出苗率[J].马志强，译.种子, 2010,29(8)：129-132.

[4] 孙群, 王建华, 孙宝启. 种子活力的生理和遗传机理研究进展[J].中国农业科学, 2007,40(1):48-53.

[5] 杜清福,贾希海,律保春,等.不同类型玉米种子活力检测适宜方法的研究[J].玉米科学, 2007,15(6):122-127.

[6] Tai Gimin, Woo Sikkang. A Simple, Quick and Nondestructive Method for Brassicaceae Seed Viability Measurement with Single Seed Base Using Resazurin[J]. Hort Environ Biotechnol,2011,52(3):240-245.

[7] Tai Gimin. Detection of Ethanol Released from Aged Radish (Raphanus sativus L.) Seeds Using Resazurin[J]. Hort Environ Biotechnol,2012,53(1):66-71.

[8] Dimitar Karakashev1, Danka Galabova1,Ivan Simeonov.Simple and rapid test for differentiation of aerobic from anaerobic bacteria[J]. World Journal of Microbiology & Biotechnology, 2003(19):233-238.

[9] Kavitha Murugan , Vidhya V I. Differential growth inhibition of cancer cell lines and antioxidant activity of extracts of red, brown,and green marine algae[J]. In Vitro Cell Dev Biol-Anima, 2013,49:324-334.

[10] Xiao Jing, Zhang Ying, zheng Jian，et al. Monitoring of Cell Viability and Proliferation in Hydrogel-Encapsulated System by Resazurin Assay[J]. Appl Biochem Biotechnol, 2010,162:1996-2007.

[11] Deborah A Hudman , Neil J Sargentini. Resazurin-based assay for screening bacteria for radiation sensitivity[J]. Hudman and Sargentini Springer Plus, 2013,2(1):55.

[12] Abdul-Baki A A, Anderson J D. Viability and leaching of sugar from germinating Barley[J]. Crop Sci, 1970,10:31-34.

[13] Dadlani M, Agrawa P K. Factors influencing leaching of sugar and electrolytes from carrots and okra seeds[J]. Scient Hort, 1983,19:39-44.

[14] 马育华.田间试验和统计方法[M].2版. 北京：农业出版社, 1993.

[15] Guerin T F, Mondido M, McClenn B, et al. Application of resazurin for estimating abundance of contaminant-degrading micro-organisms[J]. Letters in Applied Microbiology,2001,32(5):340-345.

[16] 李灵芝, 陈叔平, 卢新雄,等. 非破坏性方法测定小麦种子活力研究[J]. 华北农学报, 2002,17(2):75-81.

[17] Kataki P K, Taylor A G. Ethanol, a respiratory by product:An indicator of seed quality[M]//Ellis R H, Black M, Murdock A J, et al. Basic and applied aspects of seed biology Boston：Kluwer A cademic Publishers,1997:421-427.

[18] Chen Wenbin, Zhao Kentian. Cellular substance exudation and seed vigour[J]. J Northeast For Univ,1992, 3(1):37-41.