高效液相色谱法测定硝苯地平片含量的方法学研究

2014-03-27 10:47赵灵芝刘春叶王海洋苗延青张雪娇
化学与生物工程 2014年7期
关键词:硝苯地平药典精密度

赵灵芝,刘春叶,王海洋,苗延青,张雪娇

(西安医学院药学院,陕西 西安 710021)

硝苯地平是第一代钙拮抗剂,为抗高血压、防治心绞痛药物,是20世纪80年代中期的畅销药物之一。该药的特点是起效快、峰/谷比值高,导致了神经体液活化,经多年临床使用,疗效得到了肯定[1-4]。中国药典二部(2005年版)中收载的硝苯地平片含量测定方法为紫外可见分光光度法[5-7],该法较繁琐,并且分次定量转移时容易造成损失;此外,硝苯地平遇光极不稳定,分子内部易发生光化学歧化作用而降解为硝基苯吡啶衍生物及亚硝基苯吡啶衍生物,因此,用紫外可见分光光度法测定硝苯地平的含量可导致测定结果偏高。为客观、准确地反映硝苯地平片的实际含量,作者参照已报道硝苯地平的测定方法[8-12],建立测定硝苯地平片含量的HPLC法,并进行了方法学考察,拟为进一步完善硝苯地平片质量标准和合理利用提供理论依据。

1 实验

1.1 试药、试剂与仪器

硝苯地平标准对照品,中国药品生物制品检定所;硝苯地平片:(1)江苏制药股份有限公司,扬子江药业,批号:12031501、12072701、12083001,规格:每片10 mg;(2)南京白敬宇制药有限责任公司,利焕药业,批号:110911、120307、120601,规格:每片10 mg;(3)浙江泰利森制药有限公司,纳欣同药业,批号:120302、120406、121008,规格:每片20 mg。

甲醇,色谱纯,天津科密欧化学试剂有限公司;纯净水,娃哈哈食品有限公司。

Agilent 1260型高效液相色谱仪,安捷伦科学仪器有限公司;UV-2102 Pcs型紫外可见分光光度计,上海优尼科仪器有限公司;YP50001型电子分析天平,上海越平科学仪器有限公司;KQ5200E型超声波清洗器,昆山超声仪器有限公司;SHZ-D(Ⅲ)型循环水式真空泵,巩义予华仪器有限责任公司。

1.2 色谱条件[8-12]

色谱柱:Agilent C18柱(150 mm×4.6 mm,5 μm);柱温25 ℃;流动相:甲醇-水(60∶40,体积比),流速0.8 mL·min-1;检测波长235 nm;进样量20 μL。

1.3 方法

1.3.1 硝苯地平对照品储备液的制备

精密称取硝苯地平对照品0.0050 g,用甲醇溶解并定容于10 mL容量瓶中,摇匀,得0.5 mg·mL-1硝苯地平对照品储备液,在4 ℃冰箱中保存备用。

1.3.2 硝苯地平供试品溶液的制备

取硝苯地平10片,除去糖衣,精密称定,研细,精密称取适量置于烧杯中,加甲醇适量超声溶解,过滤,取续滤液定容于10 mL容量瓶中,得供试品溶液。

1.3.3 定量限实验

将硝苯地平对照品储备液分别稀释5倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍,得浓度为100 μg·mL-1、50 μg·mL-1、25 μg·mL-1、17 μg·mL-1、12.5 μg·mL-1、10 μg·mL-1、8.3 μg·mL-1的对照品溶液,在1.2色谱条件下进行检测。

1.3.4 检测限实验

将硝苯地平的对照品储备液分别稀释40倍、60倍、80倍、100倍,得浓度为12.5 μg·mL-1、8.3 μg·mL-1、6.25 μg·mL-1、5 μg·mL-1的对照品溶液,在1.2色谱条件下进行检测。

1.3.5 标准曲线的绘制

用移液管精密移取硝苯地平对照品储备液(c=0.5 mg·mL-1)250 μL、500 μL、1 mL、2 mL、4 mL、8 mL至10 mL容量瓶中,用甲醇定容,配制成浓度分别为12.5 μg·mL-1、25 μg·mL-1、50 μg·mL-1、100 μg·mL-1、200 μg·mL-1、400 μg·mL-1的硝苯地平标准溶液,在1.2色谱条件下进行检测。

1.3.6 精密度实验

精密移取硝苯地平对照品储备液1 mL,用甲醇定容到10 mL容量瓶中,得50 μg·mL-1硝苯地平对照品溶液,连续进样6次,计算RSD值。

精密移取硝苯地平对照品储备液250 μL,用甲醇定容到10 mL容量瓶中,得12.5 μg·mL-1硝苯地平对照品溶液,在1 h、2 h、3 h、4 h、5 h、6 h进样测定,计算RSD值。

精密移取硝苯地平对照品储备液2 mL,用甲醇定容到10 mL容量瓶中,得100 μg·mL-1硝苯地平对照品溶液,在1 d、2 d、3 d、4 d、5 d、6 d、7 d进样测定,计算RSD值。

1.3.7 稳定性实验

取供试品溶液于室温下放置0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h、24 h后进样测定,计算RSD值。

1.3.8 回收率实验

取已知含量的超声提取液样品3份,精密加入浓度为80 μg·mL-1的硝苯地平对照品溶液1 mL、2 mL、3 mL,用甲醇重新配制到标准曲线范围,在1.2色谱条件下进行检测,计算回收率。

1.3.9 硝苯地平含量测定

取3个不同厂家、9个不同批次的硝苯地平供试品溶液在1.2色谱条件下进行检测,由标准曲线计算含量。

2 结果与讨论

2.1 检测波长的确定

以甲醇作参比,将浓度为0.5 mg·mL-1的硝苯地平对照品甲醇溶液在紫外可见分光光度计上进行紫外吸收光谱扫描。结果显示硝苯地平在235~240 nm处有较大吸收,且235 nm处干扰较小,峰型对称,基线平稳。因此,确定测定波长为235 nm。

2.2 流动相的确定

本实验流动相采用中国药典二部(2010年版)中测定硝苯地平片含量所用的甲醇-水(60∶40,体积比,下同)[7],以0.5 mg·mL-1的对照品储备液进样得色谱图,见图1。

图1 以甲醇-水(60∶40,体积比)为流动相的色谱

由图1可知,以甲醇-水为流动相时,硝苯地平峰的保留时间为6~10 min,理论塔板数(以硝苯地平峰计)不低于4 000,其对称因子为1.05,与杂质峰的分离度不小于2.0。硝苯地平基线稳定、峰型好、对称性好、柱效高。因此,确定流动相为甲醇-水(60∶40)。

2.3 定量限和检测限

定量限实验结果表明,硝苯地平浓度为10 μg·mL-1时,信噪比(S/N)≥10,确定定量限为10 μg·mL-1。

检测限实验结果表明,硝苯地平浓度为6.25 μg·mL-1时,信噪比(S/N)≥3,确定检测限为6.25 μg·mL-1。

2.4 标准曲线

以硝苯地平质量浓度(μg·mL-1)为横坐标、峰面积为纵坐标绘制标准曲线,见图2。进行拟合回归,得标准曲线方程为:y=62533x-137.65,R=0.9999。表明硝苯地平在12.5~400 μg·mL-1范围内线性关系良好,而其它文献报道的硝苯地平线性范围为40~140 μg·mL-1,所以,本实验中HPLC法测定硝苯地平的定量限更低。

图2 HPLC法测定硝苯地平的标准曲线

2.5 精密度

精密度实验结果表明:峰面积的RSD值为1.08%(n=6),说明该方法的精密度高;日内精密度测定的峰面积的RSD值为1.56%(n=6),说明该方法的日内精密度较好。日间精密度测定的峰面积的RSD值为0.79%(n=7),说明该方法的日间精密度较好。

2.6 稳定性

稳定性实验结果表明,峰面积的RSD值为2.72%(n=8),说明该溶液在24 h内稳定。

2.7 回收率(表1)

表1硝苯地平回收率实验结果

Tab.1Results of nifedipine recovery experiment

由表1可知,在低、中、高3个浓度下的平均回收率分别为99.23%、99.99%、101.66%,符合要求。

2.8 硝苯地平含量测定

对9种供试品溶液按照1.2色谱条件进行检测,结果见表2。

由表2可知,不同厂家、不同批次硝苯地平片中硝苯地平含量均符合标注规格,扬子江药业、利焕药业、纳欣同药业硝苯地平含量分别为标注规格量的114.03%、113.40%、123.13%。

表2硝苯地平片的含量测定结果

Tab.2Nifedipine tablets assay results

3 结论

建立了一种快速测定硝苯地平片含量的HPLC 方法,对其进行方法学考察。色谱条件如下:采用Agilent C18柱(150 mm×4.6 mm,5 μm),以甲醇-水(60∶40,体积比)为流动相,流速0.8 mL·min-1,检测波长235 nm,柱温25 ℃,进样量20 μL。结果表明,硝苯地平在12.5~400 μg·mL-1范围内线性关系良好,定量限更低,精密度和稳定性也较好,而且加样回收率符合要求。用此HPLC法对3个不同厂家、9个不同批次的硝苯地平片进行测定,结果显示,各厂家不同批次硝苯地平片中硝苯地平含量均符合标注规格,扬子江药业、利焕药业、纳欣同药业硝苯地平含量分别为标注规格量的114.03%、113.40%、123.13%。该法专属性强、灵敏度高、结果准确、快速简便、稳定性好,是测定硝苯地平含量的有效方法,可为控制硝苯地平片质量标准和合理利用提供依据。

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