细胞免疫表型检测在急性白血病分型诊断中的应用价值

胡 瑛，秦 庆，朱蓝玉，于增国

细胞免疫表型检测在急性白血病分型诊断中的应用价值

胡 瑛，秦 庆，朱蓝玉，于增国

目的：探讨细胞免疫表型检测在急性白血病（AL）免疫分型和亚型诊断中的应用价值。方法：选择临床常用的12种单抗，应用流式细胞术（FCM）对形态学分型初诊的56例急性髓细胞白血病（AML）和28例急性淋巴细胞白血病（ALL）进行免疫表型检测与分析。结果：（1）有54例AML与免疫表型检测结果相符（符合率为96.4%），且各型均表达3种及以上髓系抗原，约90%以上AML不表达淋系抗原。（2）在2例与免疫表型检测结果不符的AML中，1例以巨核细胞抗原特异表达为主，被纠正为M7；另1例因同时表达2种髓系和淋系抗原而确诊为急性混合性白血病（HAL）。（3）经免疫表型检测能将28例ALL精确区分为T-ALL、B-ALL和T/B-ALL 3型，除后者外，B系抗原与T系抗原均不互相表达，具有较强系列专一性表达特点；T/B-ALL同时表达T系与B系抗原。结论：细胞免疫表型检测能为AL分型和亚型诊断提供客观而精确的依据，弥补并纠正形态学分型的不足与误诊，并在AML与ALL鉴别、ALL亚型区分和发现HAL、M7等方面具有较高的特异性和独特的临床应用价值。

急性白血病；免疫表型；流式细胞术；联合表达

0 引言

随着白细胞分化抗原研究的日趋深入和单克隆抗体（McAb）技术的不断提高，一种应用细胞免疫表型（immunologic phenotype）检测进行急性白血病（AL）免疫分型的方法应运而生，并已成为当今白血病分型中不可缺少的主要手段之一。该分型法通过应用McAb检测并鉴定白血病细胞所表达的系列相关抗原，能在高敏感性、高特异性条件下分析白血病细胞抗原表达的规律及特点，精确区分细胞系列来源及分化阶段，为提高AL分型诊断的准确性、合理制订治疗方案及预后评估提供重要科学依据[1-2]。为进一步探讨与客观评价细胞免疫表型检测在AL免疫分型和亚型诊断中的应用价值，现选择了临床上常用的12种单克隆抗体（以下简称“单抗”），应用流式细胞术（flow cy tometry，FCM）对形态学分型初诊的56例急性髓细胞白血病（acutemyelocytic leukemia，AML）和28例急性淋巴细胞白血病（acute lymphoblastic leukemia，ALL）进行了细胞免疫表型的检测与分析。

1 资料和方法

1.1 研究对象

选取2010年9月至2012年5月间本院血液内科收治的AL患者84例，所有病例初诊均按照法、美、英（French American British，FAB）协作组分型标准确定白血病类型[3]。其中，AML 56例（M1型7例、型15例、M3型11例、M4型6例型8例型5例、M6型 4例），ALL 28例（L1型11例、L2型15例、L3型2例）；男性53例、女性31例；年龄为5～68岁，平均年龄36岁。

1.2 试剂与仪器

1.2.1 主要试剂

溶血剂、改变细胞膜渗透性试剂盒、荧光剂异硫氰酸荧光素（FTIC）、藻红蛋白（PE）及全部单抗均购自法国Immunotech公司。所选单抗共计12种，包括髓系单抗B细胞单抗T细胞单抗（CD5、 CD7），巨核细胞单抗及无系列特异性单抗

1.2.2 主要仪器

FACSCalibur型流式细胞仪（Becton-Dickinson，美国B-D公司生产）。

1.3 免疫表型检测与分型

治疗前行髂骨前穿刺抽取骨髓，制备肝素抗凝骨髓液；取肝素抗凝骨髓液3～5mL，经淋巴细胞分离液密度梯度离心法分离制备单个核细胞悬液，将细胞水平调至1×109个/L；分别以单抗标记染色，每管加20μL单抗及50μL单个核细胞悬液，避光室温反应15min，加溶血剂混匀，10min后上流式细胞仪检测。检测采用直接免疫荧光技术三标法分析，测定前以标准校正荧光微球校正仪器，以双参数散点图设门，每支测定管收集1×104个细胞，结果判定以白血病细胞群表面抗原阳性率≥20%为阳性并且为阳性，采用CellQuest软件进行分析。免疫学分型标准参照国际白血病欧洲协作组（EGIL）1995年颁布的分类法[4]。

2 结果

2.1 56例AML免疫表型检测结果与分型

在56例初诊的AML中，有54例与免疫表型检测结果相符。其中，抗原和在AML各型中均呈高水平表达主要表达在中；无系列特异性抗原在M3中未见阳性表达，HLADR表达率亦极低（9%）；除5例伴抗原CD7表达外，90%以上AML不表达淋系抗原。有2例AML免疫表型检测结果与初诊结果不符，其中1例以特异表达为主，故纠正为M7；另有1例M4因同时表达和而确诊为混合性白血病（HAL）。各型CD抗原表达情况与免疫学分型结果见表1。

表1 56例AML免疫表型检测的结果与分型 例

2.2 28例ALL免疫表型检测结果与分型

经免疫表型检测可将28例ALL区分为：T-ALL 9例、B-ALL 18例和T/B混合型ALL（T/B-ALL）1例。T-ALL主要表达CD5、CD7，B-ALL主要表达在T-ALL与B-ALL二者之间T、B系抗原均无互相表达现象；T/B-ALL则同时表达T系与B系抗原。3型ALL中均存在有不同程度的髓系与淋系抗原交叉表达现象。各型ALL的CD抗原表达情况与免疫学分型结果见表2。

表2 28例ALL的免疫表型检测的结果与分型例

3 讨论

有研究表明，细胞表面抗原是细胞分化过程中基因表达的产物，并随着细胞分化阶段不同而有序地获得或消失[5]。因此，通过检测与分析细胞免疫表型，对揭示白血病细胞的克隆特点、生物学特性、分化阶段及其异质性均具有很高的实用价值。本文在对56例AML免疫表型检测结果分析中发现，有54例免疫表型检测结果与形态学分型相符（符合度为96．4%），且各型均表达≥3种髓系抗原，但各种髓系抗原在不同亚型中的阳性表达率有一定差别，其中阳性54例（100%）阳性15例（27．8%），阳性44例（81．5%）阳性50例（92．6%）；阳性表达率从大到小依次为除极少数病例外，约90%以上AML不表达淋系抗原。上述结果说明，虽然迄今为止还没有抗AML及其各型特异性抗原的抗体，不能准确区分AML各亚型，但以多种髓系抗原联合表达则是AML细胞免疫表型的主要特征，尤其是CD13与CD33的高表达，对判断AL是否为髓系来源以及AML与ALL的鉴别具有很高的应用价值，可作为AML最特异的免疫标志。文献[6]报道：CD14抗原是单核系细胞最特异性免疫标志物，在本研究中的5例M4、7例M5a和5例M5b均呈高水平表达（分别为60%、100%、100%），而在AML其他亚型中均无阳性表达。由此提示，在形态学分型基础上的免疫表型检测很有必要，有助于M4、M5a和M5b与其他亚型鉴别，使其分型诊断更加客观与准确。HLA-DR和CD34均是造血干/祖细胞的相关抗原，随细胞成熟其表达逐渐减弱直至消失[7]，本研究中的11例M3仅有1例HLA-DR呈阳性表达，CD34抗原却无1例阳性，而其他AML各亚型均有较高表达，这一现象可能与早幼粒白血病细胞来源于较成熟的粒系祖细胞有关。因此，HLA-DR和CD34抗原表达消失，对鉴别非典型M3是极为重要的。此外，有2例M1和3例M2a除相关髓系抗原表达外，还伴有淋系抗原（CD7）表达，实际上是伴淋系抗原表达的急性髓系白血病（Ly＋-AML），是较不分化的AML一个标志，可能与某一髓系祖细胞相关[8]。

需要特别说明的是，在56例AML中发现有2例形态学分型发生错误，即1例初诊为M5a者是以巨核细胞抗原CD41、CD61特异表达为主，而无单核细胞特异性抗原CD14表达，故将其纠正为M7；另有1例形态学初诊为M4者，免疫表型检测却同时表达髓系抗原CD13、CD14、CD33和T系抗原CD5、CD7，符合HAL同时至少表达2种髓系和淋系抗原的特征，而非M4型，故参照国际白血病欧洲协作组（EGIL）1995年推荐的积分标准[4]，确诊为HAL。显然，细胞免疫表型检测突出优点之一在于能够发现并纠正AML形态学分型的错误，这对于降低误诊率具有十分重要的价值。

从28例ALL检测结果可以看出，免疫表型能将其精确区分为T-ALL 9例，B-ALL 18例，T/B-ALL 1例。各种淋系抗原分别在不同类型ALL中呈高水平表达，T-ALL表达CD5有8例（88.9%）、表达CD7有9例（100%）；B-ALL表达CD10有13例（72.2%）、表达CD19有18例（100%），尤以CD7与CD19分别在T-ALL和B-ALL中表达率最高，并且T、B系抗原均无互相表达现象。显而易见，B系抗原CD10、CD19与T系抗原CD5、CD7两者均具有极高的敏感性和较强的系列专一性表达特点，不失为ALL分型与鉴别的良好指标。在本研究中发现1例T/B-ALL，同时表达B系抗原与T系抗原，其实质上是白血病细胞的双表型，被认为是HAL 3种类型之一，表明该细胞克隆恶变水平在多能干细胞或以上阶段[9-10]。此外，CD13、CD33虽为髓系较特异抗原，但在9例T-ALL中有2例（22.2%）、18例B-ALL中有3例（16.7%）表达，证明在相当数量ALL中存在髓系与淋系抗原交叉表达现象，亦是一种伴髓系抗原表达ALL），尤以T-ALL更为突出，这与Preti的报道大致相同[11]。另外，在28例ALL中，均伴有无系列特异性抗原HLA-DR、CD34较高水平的表达，提示可能系起源于较早期造血细胞的恶性转化结果。所以，ALL免疫表型检测较传统形态学分型的最大优势，在于能够显示不同恶性克隆来源ALL的不同生物学特征和细胞所处分化阶段，对准确区分与诊断T-ALL、B-ALL和T/B-ALL具有不可替代的作用。

总之，上述研究事实清楚地表明，细胞免疫表型检测能从造血细胞克隆进化过程中分化抗原表达的这一角度，揭示髓细胞和淋巴细胞的克隆源性及分化阶段，能为AL分型和亚型诊断提供客观而精确的依据，弥补并纠正形态学分型的不足与错误，在AML与ALL鉴别、ALL亚型的区分和发现HAL、AML-M7等方面具有独特的临床应用价值。

[1] 张纯，李睿，赵菲，等.急性白血病细胞形态学与免疫学分型的关系[J].中国癌症杂志，2007，17（8）：615-618.

[2] 易丽萍，哈利达·亚森.免疫分型及临床应用[J].中国组织工程研究与临床康复，2009，13（5）：903-906.

[3] 张之南.血液病诊断及治疗标准[M].3版.北京：科学出版社，2007：106-113.

[4] BeneM C，CastoldiG，Knapp W，etal.Proposals for the immunological classification of acute leukemia[J].Leukemia，1995，9（10）：1 783-1 786.

[5] 舒文秀，陈燕.急性淋巴细胞白血病免疫分型的特点及其临床意义[J].临床血液学杂志，2005，18（2）：103-106.

[6] 丁邦胜，翟志敏，何晓东，等.急性白血病形态学与免疫学分型[J].蚌埠医学院学报，2003，28（4）：297-299.

[7] 黄欣.流式细胞术用于急性白血病免疫学分型现状[J].检验医学与临床，2006，3（4）：160-162.

[8] Kornblau SM，ThallP，Huh YO，etal.AnalysisofCD7expression in at cute myelogenous leukemia：martingale residual plost combined with optimal cutpoint analysis reveals absence of prognostic significance[J].Leukemia，1995，9（10）：1 735-1 741.

[9] Paredes-Aguilera R，Romero-Guzman L，Lopez-Santiago N，et al. Flow cytometric analysisof cell-surface and intracellular antigens in the dignosisof acute leukemia[J].Am JHematol，2001，68（2）：69-74.

[10]孙秀丽，方美云，姜凤，等.免疫分型用于68例急性白血病分型[J].中国实验血液学杂志，2006，14（1）：39-41.

[11]Preti H A，Huh Y O，Brien O，et al.Myeloidmarkers in adult lymphoblastic leukemia[J].Br JHematol，1996，93（2）：61.

（收稿：2013-08-18 修回：2013-11-10）

Application value of cell immunophenotype detection in diagnosis of acute leukemia

HU Ying1,QIN Qing1,ZHU Lan-yu2,YU Zeng-guo2
(1.Department of Clinical Laboratory,the 210th Hospital of the PLA,Dalian 116021,Liaoning Province,China; 2.Medical College of Dalian University,Dalian 116622,Liaoning Province,China)

Objective To investigate the application value of cell immunophenotype detection in the diagnosis of acute leukemia (AL)immune type and subtype.Methods Totally 12 kinds ofmonoclonal antibodies and flow cytometry(FCM) were used for the detection and analysis of immunophenotype of 56 acute myeloid leukemia(AML)patients and 28 acute lymphocytic leukemia (ALL)patients diagnosed with morphological classification.Results There were 54 cases of AML matching with the detection results of immunophenotype with the accuracy of 96.4%,and each was expressed in 3 or above myeloid antigen,and aboutmore than 90%AML did not express lymphoid antigens;in the 2 cases notmatching with the detection results,there was one case with giant cell nuclear antigen specific expression was corrected as M7,and one case also expressed as 2 kinds ofmyeloid and lymphoid antigen was diagnosed as acute hybrid leukemia(HAL).Detected by immunophenotyping,28 cases of ALL could be accurately distinguished as three kinds such as T-ALL,B-ALL and T/B-ALL,and except the latter,B antigen and T did not mutually express each other,with the characteristics of strong series specific expression;T/B-ALL expressed both T and B antigen.Conclusion The cell immune phenotype detection can provide objective and accurate basis for AL type and subtype diagnosis and misdiagnosis,as well asmake up for the deficiency and correctmorphological classification,and has specific and unique clinical application value in the aspects of distinguishing AML and ALL,differentiating ALL subtype and discovering HAL,M7etc. [Chinese Medical Equipment Journal，2014，35（8）：83-85]

acute leukemia;immunophenotype;flow cytometry;jointexpression

R318；R446

A

1003-8868（2014）08-0083-03

10.7687/J.ISSN1003-8868.2014.08.083

胡 瑛（1983—），女，检验师，主要从事医学检验方面的研究工作，E-mail：huying_may@163. com。

116021辽宁大连，解放军210医院检验科（胡 瑛，秦 庆）；116622辽宁大连，大连大学医学院（朱蓝玉，于增国）

于增国，E-mail：yuzengguo@163.com