原子力显微镜在环境微生物成像中的条件研究

李冬梅，张金娜，刘俊峰，施雪华

(哈尔滨工业大学 市政环境工程学院,城市水资源和水环境国家重点实验室,黑龙江 哈尔滨 150090)

原子力显微镜是近年来较为重要的表面成像技术的进展之一，其原理[1-2]是利用激光束的偏转法，将针尖制作在一个对微弱力极为敏感的V形的微悬臂上，微悬臂的另一端固定，使针尖趋近样品表面并与表面轻轻接触，由于针尖尖端原子与样品表面原子之间存在着微弱的排斥力，当针尖进行扫描时，可通过反馈系统控制压电陶瓷管伸缩来保持原子间的作用力恒定，带有针尖的微悬臂将随着样品表面的起伏而颤动，利用光学监测方法得到样品表面形貌的信息。

原子力显微镜已经在许多科研领域得到了广泛的应用，包括微生物细胞的形态观察[3-5]、生物大分子的结构观察及生理生化过程分析[6-9]、化学材料的表面特征分析[10-11]。目前针对原子力显微镜系统成像的仪器参数优化获得高质量图像的研究相对较少，本文通过比较研究细菌的成像条件，优化AFM系统的仪器操作参数，以期为原子力显微镜在环境微生物样品的观察过程中提供一定的参考依据。

1 材料方法

1.1 材料和仪器

目标菌株：本试验采用的细菌菌株是从污泥中分离获得的具有反硝化功能的菌株S。

实验仪器：美国维易科公司Bioscope型号原子力显微镜(AFM)系统，探针型号为RTESP，弹性系数40 N/m；日本Olympus公司BX51型号光学显微镜。

1.2 样品预处理

(1) 样品收集：取液体培养中处于对数生长期的菌株S 1mL放于1.5 mL离心管中，5 000 r/min离心10 min，并弃去上清。

(2) 样品纯化：利用1×PBS 将样品离心冲洗3 次。

(3) 样品固定：加入200 μL、2.5%的戊二醛溶液，混匀后固定3 h。

(4) 载玻片清洗：将载玻片放入重铬酸钾洗液中浸泡过夜后，用蒸馏水冲洗3次，再用超纯水冲洗3次，放置架上，于无菌操作台中自然风干后备用。

(5) 上样：在无菌操作台中用微量移液器取10 μL固定后的菌液滴于载玻片中央，用接种环均匀涂布后自然风干。

(6) 光学显微镜观察：将上样风干后的载玻片放于光学显微镜下进行观察，确定待观察菌株的相对位置。

(7) 原子力显微镜观察：调整原子力显微镜的成像条件进行菌株的形态观察。

1.3 成像条件确定

利用原子力显微镜进行菌株的形态学表征，需要对原子力显微镜的成像条件进行优化。细菌形态观察的主要影响条件包括扫描频率、扫描力及信号反馈信号的积分常数。本文采用轻敲模式，比较研究上述3个条件对细菌成像的影响。

2 结果与讨论

2.1 不同扫描频率对成像结果的影响

原子力显微镜系统中的扫描频率决定图像的扫描速度，频率越高，探针在样品表面的移动速度越快，对于表面结构复杂的细菌样品来说，其表面的细微结构就很容易被忽略，得到的图像信息相对较少而且也不够清晰；频率越慢，则探针在样品表面的移动速度越慢，得到的图像越清晰且图像信息也相对完整，但耗时较长，增加了探针的磨损程度。因此，对于不同的样品，应该采取不同的扫描频率。

以菌株S为例，分别以0.2、0.5、1、1.5、2 Hz 5种扫描频率进行细菌成像，并且固定其电压输出值为1 mv左右，积分常数/比例常数为0.6/0.8，得到细菌图像见图1。从成像结果可知，当频率为1.5 Hz和2 Hz时，细菌图像边缘模糊变形，不能清晰显示细菌图像；而当频率为0.2、0.5、1 Hz时，可以从图片有半部分的相位像进行观察分析，可以看出频率为1 Hz时，其相位像表面较为粗糙；考虑到扫描时间过长会加快探针的磨损程度，应该选择0.5 Hz作为菌株S的扫描速度。

图1 5种扫描频率的细菌图像

2.2 不同扫描力对成像结果的影响

在原子力显微镜系统中扫描力的表现形式为输出的电压值，电压值越大，探针对样品的作用力越小。反之，电压值越小，探针对样品的作用力越大，探针跟踪样品越好，但需要注意，探针对样品的力越大，越容易损伤样品。在图像观察过程中，输出的电压是一个即时变化参数，需要根据两条曲线是否相同进行不断调整，以保证图像宏观的完整性且不易发生变形.

以菌株S为例，在2 Hz的扫描频率积分常数/比例常数为0.6/0.8的条件下，固定其电压输出值为1.002 V时的效果如图5所示，可以看出图像发生变形，而及时调整电压输出值使trace、retrace曲线相趋近，此时的电压输出值为1.106 mV，效果见图2，虽然相位像的效果较输出电压为1.002 mV 较为粗糙，但是菌体的效果图并不发生变形，宏观上图像的信息较为完整。

图2 扫描力为1.106 mV的细菌图像

2.3 不同积分常数对成像结果的影响

原子力显微镜系统中的积分常数对探针探测的反馈信号进行数字到图像转换的效果有影响，如图3所示。选择合适的积分常数才能将图像的三维结构显示出来，积分常数越小，其图像的立体结构较差，体现为平面图像变形，如图3(a)所示；积分常数越大，图像的立体结构较强，但同时也会增加干扰信号，干扰信号在相位像中会体现出来，如图3(d)所示；当控制积分常数/比例常数为0.4/0.6时，菌株S的边缘效果与积分常数/比例常数为0.6/0.8时相比较为模糊。因此，获得菌株S的最佳成像效果的积分常数/比例常数应为0.6/0.8。

图3 不同的积分常数的细菌图像

3 结论

原子力显微镜在环境微生物样品的形态学鉴定及观察中的应用越来越广泛，本文针对原子力图像观察菌株样品过程中的仪器参数调控进行了比较研究，具有一定的参考价值。结果表明：控制扫描频率为0.5 Hz时获得的图像清晰度高；控制积分常数/比例常数为0.6/0.8时，原子力显微镜系统可以实现从数字到图像最佳转换，图像的三维效果好，且背景的干扰信号较小；扫描力的控制体现在系统的电压输出值，该值的最佳数值应根据trace曲线和retrace曲线的变化即时调节，使二者趋于重合的电压值即为最适扫描力。

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