MRI对比剂在细胞示踪中的研究进展

侯军霞 综述，曾维政审校

（中国人民解放军成都军区总医院消化内科，成都 610083）

细胞治疗是近年来医学研究的热点，并展现了极好的前景，广泛应用于心血管疾病、神经系统疾病、糖尿病、肝病、肿瘤等领域。移植细胞在体内的迁移、分布、增殖及分化等因素直接关系到治疗能否成功，因此，非侵入性的细胞示踪技术成为焦点。目前常用的体内细胞示踪技术包括核素成像、光学成像和核磁共振成像技术。核素成像技术通过核素（如18F、99mTc、111IN等）标记细胞，用PET／SPECT方法可以进行动态监测，敏感度及特异度高，但具有空间分辨率低、标记物存在辐射、半衰期短等缺点。光学成像技术则是通过生物发光剂和内源性荧光报告基因或是外源性探针来检测分子和生化进程的无创技术，具有高敏感性、无电离辐射、可量化及费用相对较低等优点，但是空间分辨率低、光源在生物体内易发生散射、有背景光干扰。核磁共振成像（magnatic resonance image，MRI）技术是利用体内固有的原子核（氢质子），在外加磁场的作用下产生共振现象，将获得的电信号经过计算机处理后，重建出人体某一层面的图像的诊断技术，由于空间分辨率高、敏感度强，无电离辐射、广泛应用于临床等特点，受到众多研究者的青睐。现将MRI对比剂在细胞示踪中的研究进展做一综述。

1 氧化铁颗粒

氧化铁通过缩短自旋－自旋弛豫时间／横向弛豫时间（T2），产生负性对比效应，在T2W1和T2＊W1上显示为低或无信号。为了增加氧化铁颗粒的稳定性和可溶解性，降低对细胞功能的影响，用于细胞标记的氧化铁颗粒通常是由右旋糖酐、聚乙二醇（PEG）或聚苯乙烯等包裹Fe2＋和Fe3＋的氧化物的核构成［1］。按照颗粒直径的大小，氧化铁颗粒可以分为：超顺磁氧化铁颗粒（superparamagnetic iron oxide，SPIO，直径50～200 nm），超小超顺磁氧化铁（ultra small superpara－magnetic iron oxide，USPIO，直径35nm）和微米顺磁氧化铁纳米粒子（monocr－ystalline iron oxide nanocompound，MPIO，直径约1 μm）［1］。其中 MPIO含铁量最高，是最敏感的对比剂，但因其由聚苯乙烯包被而成，不能被生物降解，长期存留在体内的影响未知，因此限制了MPIO在动物研究及临床中的应用［2］。

迄今为止，SPIO是惟一被批准用于临床的对比剂。因其可被肝、脾、骨髓、淋巴结中的巨噬细胞吞噬而显影，早在1996年美国FDA就批准SPIO用于临床作为特异性的肝脏对比剂使用。SPIO具有生物降解性，被细胞代谢后可进入正常血浆铁池与血红蛋白结合或参与其他代谢过程［3］。通常用于MRI细胞示踪的SPIO量约为10pg／细胞，有研究表明，该剂量对细胞没有表现出明显的不良反应，并且细胞内铁的代谢较慢，但较高浓度的铁（＞20pg）对细胞具有毒性作用，因为游离铁离子在细胞内产生羟自由基可致细胞DNA变性［4－6］。

在健康志愿者大腿皮下注射结核杆菌诱导皮肤炎症，并将SPIO标记后的外周血单核细胞静脉输注到志愿者体内，MRI可观察到SPIO标记细胞迁移到炎症皮肤，且皮肤活检证实了普鲁士蓝染色阳性细胞存在［7］。SPIO标记间充质干细胞后移植到多发性硬化症和脊髓侧索硬化症患者的鞘膜腔及脑室内，应用MRI观察细胞的迁移和分化，未发现与SPIO标记有关的病理改变，表明SPIO用于临床是安全可行的［1］。

SPIO及细胞表面均带负电荷，不易通过胞吞或胞饮作用进入非吞噬细胞体内，为增加细胞标记效率，目前最常用的方法是将SPIO颗粒包被上多聚阳离子从而使促SPIO与细胞膜结合，促进吞噬。常用的转染试剂有多聚赖氨酸、鱼精蛋白硫酸酯、阳离子脂质体等，通过简单的孵育即可以标记细胞［1］。其他标记方法有电穿孔和超声脉冲等。

尽管如此，SPIO作为MRI细胞示踪剂仍有一些局限性：（1）敏感度相对较低；（2）随着移植细胞迅速分裂，SPIO浓度会被稀释；（3）标记细胞死亡后被吞噬细胞或其他细胞吞噬，出现假阳性；（4）由于出血灶内含有含铁血红素，与标记细胞不易区分。

2 顺磁性物质

顺磁性物质用于 MRI对比剂主要有钆（Gd3＋）和锰（Mn2＋）两类，通过影响自旋－晶格弛豫时间／纵向弛豫时间（T1），产生T1正性对比效应，在T1WI显示为高信号。

钆含有最多的不成对电子（7个），是最有效的顺磁对比剂［1］。但因Gd3＋有细胞毒性，通常使用其螯合物来减少对细胞的损害。钆螯合物在低浓度下主要是缩短T1成为阳性对比剂，而在高浓度时，Gd3＋以缩短T2为主成为MR阴性对比剂。目前用于细胞标记的浓度10～80mmol／L则以缩短T1为主［8］。目前钆对比剂主要包括 Gd－DPTA、Gd－DOTA、Gd－DO3A 等，其 中 Gd－DTPA（Gadopen－etate dimeglumine；商 品名：马根维显，Magnevist）是临床最常用的对比剂，主要用于增强全身血供丰富的组织和病变，其临床不良反应主要与过敏有关，进入体内的Gd－DTPA 99%可经肾脏迅速清除和排泄，因此临床上是安全的［1，9－10］。

但是Gd－DTPA用于细胞标记体内示踪却受到限制：（1）敏感度低，且成像效果不如SPIO，（2）在细胞的溶酶体内钆螯合物可能会迅速崩解，而钆（Gd3＋）可以导致肾脏纤维化已经得到证实［9－10］。因此不适用于体内细胞示踪的研究。

为了减少钆对细胞的毒性影响及增强阳性对比效应，出现了许多新型的对比剂。钆己二酮纳米颗粒（GdH－NP）直径约140nm，无细胞毒性，用于人MSCs标记不影响细胞表面抗原表达，且内吞入细胞内的含量比GD－DTPA高3倍，表明细胞标记低浓 度的 GdH－NP即 可 获得较好 的 MRI影 像［11］。Gd2O3＠MCM－41（gadolinium－doped mosoporous silica MCM－41）拥有六角中孔结构，可聚集纳米大小的Gd2O3粒子，对细胞增殖无毒，并对标记的细胞分化潜能影响较小，标记的神经干细胞（NSCs）在小鼠的脑内可被临床3TMRI观察14d，组织切片免疫荧光检测证实了标记细胞的存在［12］。超小顺磁Gd2O3纳米颗粒（直径1.3nm）被聚乙二醇（PEG）包被后，形成胶状的水性介质，具有较高的纵向弛豫时间和小的r2／r1比率。用于标记F98脑癌细胞（多形性胶质母细胞瘤），标记后移植到小鼠脑中应用MRI观察细胞的迁移，结果在移植后48 h每个移植动物都发现了脑瘤存在，表明超小PEG－Gd2O3纳米颗粒可提供较强的阳性对比增强效应，使体内标记细胞可视化［13］。

Mn2＋是最早用于研究活体细胞示踪的磁性粒子，有5对不成对电子，磁性和磁化率强于螯合的钆。将MnCl2标记的外周血单核细胞经肌肉注射移植到大鼠缺血下肢中，使用MRI观察7～20d发现Mn标记的MNCs分布与SPECT评价111In标记的MNCs及荧光显微镜观察Dil染色分布一致［14］。但Mn2＋具有细胞毒性，通过大鼠玻璃体注射不同浓度的MnCl2，随着浓度的增高，视网膜神经节细胞的密度迅速减少；高浓度的MnCl2对视网膜的毒性还包括线粒体病变，视网膜神经节细胞分布异常，以及光感受器和视网膜色素上皮细胞的异常等［15］。

3 19F

19FMRI成像原理不同于SPIO，与氢核质子无关，主要依赖于19F的自旋密度加权。因体内背景信号低，尽管19F的影像信噪比明显低于普通1HMRI，但检测到的19F信号均来自标记细胞，而且获得信号强度与19F的量成正比，因此，可以量化标记细胞［16］。19F示踪方法的发展，依赖于过氧化碳（PFC）的使用。

PFC主要作为人工血液在手术中使用，也可作为血管系统的对比剂，是疏脂、疏水分子，不与细胞膜融合，需要制备成纳米乳剂才能进入细胞。目前体内尚未发现可代谢PFC的酶，且在低pH值环境中可稳定存在，因此不会被溶酶体降解；进入体内的PFC主要通过网状内皮系统代谢作用后经过肺呼出［16－17］。研究表明，PFC标记细胞低于1011～1012个氟原子／细胞时，不会产生明显的不良反应［17］。19F标记鼠的骨髓HSCs可造成细胞活力一过性降低，但随后恢复正常，且标记不改变细胞的分化潜能；在体内试验中，标记后的HSCs可在脾脏内发育成正常的CFU，在淋巴和骨髓重建上与未标记细胞并无差别，表明标记后的 HSCs仍保持了治疗功能和潜能［18］。19FMRI检测敏感度高，在高磁场的MRI系统中可以检测到1 000个标记细胞／voxe，Boehm－Sturm等［19］用19F标记人的神经干细胞，体内外未见对细胞增殖和分化有影响，标记后的神经干细胞注射到小鼠的纹状体，可用19F MRI检测到标记细胞，且获得影像学图像与组织学检查一致。

由于19FMRI需要特殊设备，且对细胞毒性的影响不明，还需进一步研究。但19F有望成为新的细胞示踪方法来了解细胞行为。

4 报告基因

报告基因技术是将目的基因导入靶细胞使某种物质过表达，从而被报告探针所检测的方法。主要用于放射性核素方面，目前已经在MRI检查中得到发展［20］。

常用的MRI报告基因有：铁蛋白、转铁蛋白和转铁蛋白受体，这些蛋白可使铁在体内蓄积，通过改变T2弛豫时间报告蛋白的活性。Iordanova等［21－22］将铁蛋白基因导入小鼠脑室下的神经祖细胞内，并将转染后细胞注射到小鼠纹状体，用MRI检测到了内源性神经祖细胞迁移到嗅神经球；研究发现随着细胞铁蛋白表达增加，细胞膜转运蛋白也有所增加，从而将铁贮存在细胞内成像。

报告基因的优势在于：（1）只有活细胞才能表达报告基因；（2）报告基因会随细胞分裂传给子细胞，不会导致标记稀释；（3）将报告基因整合与特定细胞产物的启动子相连，报告基因可反应干细胞的分化类型。

使用金属蛋白酶报告基因为基础的MRI示踪技术也不是没有局限性，需要考虑到时间问题：在细胞内的铁能够被检测到均需要时间的积累，因此所检测到的信号与细胞活力直接的关系很难理解。

5 异体微胶囊

壳聚糖／藻酸盐微胶囊是一种新型的生物材料，生物相容性好，扩散性强，允许小分子营养物质自由出入细胞，如葡萄糖、氧气、胰岛素等，但限制免疫球蛋白或抗原提呈细胞等进入。因此，可以使得移植的异体细胞免受免疫排斥，也可避免免疫抑制药物的不良反应［23］。

将对比剂标记在胶囊里制备成磁胶囊，可以通过MRI技术对移植细胞进行非侵入性检查。因为对比剂并非直接标记细胞，所以可增加对比剂的量而提高敏感度，而不增加细胞毒性［23］。对于干细胞治疗，细胞旁分泌机制的作用远大于直接分化为目的细胞，用微胶囊可提高细胞在宿主体内的生存率，减少治疗所需细胞数量［24］。将含有脂肪间充质干细胞的磁性微胶囊移植治疗急性心肌梗死猪模型，在移植后30d仍可用MRI观察到标记细胞，而单纯用SPIO标记的细胞则出现信号的缺失，表明磁性微胶囊可使细胞更好地停留在缺血心肌中，但在改善心肌梗死面积及心功能方面，两组间无明显差异［25］。磁性微胶囊不影响细胞活性及功能，且有利于体内细胞示踪，具有广泛的应用前景。

6 展 望

理想的MRI细胞标记技术应该满足以下特征：有较好的生物相容性，低毒或无毒，敏感度高，稳定性强，较高的信噪比，不会随细胞分裂增殖而稀释，也不会转染周围细胞，允许长时间示踪细胞。如果满足上述各种条件，则可通过MRI进行细胞的实时监测，并可在MRI引导下进行细胞精确移植。尽管目前尚无对比剂满足上述所有标准，但随着细胞示踪技术研究的深入，相信MRI细胞示踪技术会对细胞治疗带来深远影响。

［1］Cromer Berman SM，Walczak P，Bulte JW.Tracking stem cells using magnetic nanoparticles［J］.Wiley Interdiscip Rev Nanomed Nanobiotechnol，2011，3（4）：343－355.

［2］Long CM，Bulte JW.In vivo tracking of cellular therapeutics using magnetic resonance imaging［J］.Expert Opin Biol Ther，2009，9（3）：293－306.

［3］Choi D，Kim JH，Lim M，et al.Hepatocyte－like cells from human mesenchymal stem cells engrafted in regenerating rat liver tracked with in vivo magnetic resonance imaging［J］.Tissue Eng Part Method，2008，14（1）：15－23.

［4］Chen IY，Greve JM，Gheysens O，et al.Comparison of optical bioluminescen－ce reporter gene and superparamagnetic iron oxide MR contrast agent as cell markers for noninvasive imaging of cardiac cell transplantation［J］.Mol Imaging Biol，2009，11（3）：178－187.

［5］Henning TD，Wendland MF，Golovko D，et al.Relaxation effects of ferucarbotran－labeled mesenchymal stem cells at 1.5Tand 3T：discrimination of viable from lysed cells［J］.Magn Reason Med，2009，62（2）：325－332.

［6］Henning TD，Sutton EJ，Kim A，et al.The influence of ferucarbotran on the chondrogenesis of human mesenchymal stem cells［J］.Contrast Media Mol Imaging，2009，4（4）：165－173.

［7］Richards JM，Shaw CA，Lang NN，et al.In Vivo Mononuclear Cell Tracking Using Superparamagnetic Particles of Iron Oxide Feasibility and Safety in Humans［J］.Circ Cardiovasc Imaging，2012，5（4）：509－517.

［8］Baligand C，Vauchez K，Fiszman M，et al.Discrepancies between the fate of myoblast xenograft in mouse leg muscle and NMR label persistency after loading with Gd－DTPA or SPIOs［J］.Gene Ther，2009，16（6）：734－745.

［9］Bulte JW.In vivo MRI cell tracking：clinical studies［J］.AJR Am J Roentgenol，2009，193（2）：314－325.

［10］Thomsen HS.Nephrogenic systemic fibrosis：a serious late adverse reaction to gadodiamide［J］.Eur Radiol，2006，16（12）：2619－2621.

［11］Tseng C，Shih IL，Stobinski L，et al.Gadolinium hexanedione nanoparticles for stem cell labeling and tracking via magnetic resonance imaging［J］.Biomaterials，2010，31（20）：5427－5435.

［12］Shen Y，Shao Y，He H，et al.Gadolinium3＋－doped mesoporous silica nanoparticles as a potential magnetic resonance tracer for monitoring the migration of stem cells in vivo［J］.Int J Nanomedicine，2013，8：119－127.

［13］Faucher L，Tremblay M，Lagueux J，et al.Rapid synthesis of PEGylated ultrasmall gadolinium oxide nanoparticles for cell labeling and tracking with MRI［J］.ACS Appl Mater Interfaces，2012，4（9）：4506－4515.

［14］Odaka K，Aoki I，Moriya J，et al.In vivo tracking of transplanted mononuclear cells using manganese－enhanced magnetic resonance imaging（MEMRI）［J］.PLoS One，2011，6（10）：e25487.

［15］Luo L，Xu H，Li Y，et al.Manganese enhanced MRI optic nerve tracking：effect of intravitreal manganese dose on retinal toxicity［J］.NMR Biome，2012，25（12）：1360－1368.

［16］Srinivas M，Heerschap A，Ahrens ET，et al.19F MRI for quantitative in vivo cell tracking［J］.Trends Biotechnol，2010，28（7）：363－370.

［17］Srinivas M，Turner MS，Janjic JM，et al.In vivo cytometry of antigen specific T－cells using19F MRI［J］.Magn Reson Med，2009，62（3）：747－753

［18］Helfer BM，Balducci A，Sadeghi Z，et al.19F MRI tracer preserves in vitro and in vivo properties of hematopoietic stem cells［J］.Cell Transplant，2013，22（1）：87－97.

［19］Boehm－Sturm P，Mengler L，Wecker S，et al.In vivo tracking of human neural stem cells with19F magnetic resonance imaging［J］.PLoS One，2011，6（12）：e29040.

［20］Kraitchman DL，Bulte JW.In Vivo imaging of stem cells and beta cells using direct cell labeling and reporter gene methods［J］.Arterioscler Thromb Vasc Biol，2009，29（7）：1025－1030.

.［21］Iordanova B，Ahrens ET.In vivo magnetic resonance imaging of ferritin－based reporter visualizes native neuroblast migration［J］.Neuroimage，2012，59（2）：1004－1012.

［22］Iordanova B，Robison CS，Ahrens ET.Design and characterization of a chimeric ferritin with enhanced iron loading and transverse NMR relaxation rate［J］.J Biol Inorg Chem，2010，15（6）：957－965.

［23］Barnett BP，Arepally A，Karmarkar PV，et al.Magnetic resonance－guided，real－time targeted delivery and imaging of magnetocapsules immunoprotecting panc－reatic islet cells［J］.Nat Med，2007，13（8）：986－991.

［24］Doyle B，Sorajja P，Hynes B，et al.Progenitor cell therapy in a porcine acute myocardial infarction model induces cardiac hypertrophy，mediated by paracrine secretion of cardiotrophic factors including TGFbeta1［J］.Stem Cells Dev，2008，17（5）：941－951.

［25］Gomez－Mauricio RG，Acarregui A，Sánchez－Margallo FM，et al.A preliminary approach to the repair of myocardial infarction using adipose tissue－derived stem cells encapsulated in magnetic resonance－labelled alginate microspheres in a porcine model［J］.Eur J Pharm Biopharm，2013，84（1）：29－39.