DKK－1与肿瘤的研究进展

黄晓红（综述），游金辉（审校）

（川北医学院附属医院核医学科，南充 637000）

1 DKK基因

DKK（Dickkopf）是一组分泌型糖蛋白，Wnt通路抑制因子，其包含 DKK－1、DKK－2、DKK－3、DKK－4和 DKKL－1（Dickkopf－like protein 1，Soggy），它们由225～350个氨基酸残基的蛋白质组成，DKK－1、DKK－2、DKK－4相对分子质量约25～29k，DKK－3相对分子质量约38k。DKKs由2个富含半胱氨酸的保守区域及与之连接的不等长区域构成，每个富含半胱氨酸区域包含10个半胱氨酸残区。每个富含半胱氨酸区域的氨基末端（the amino－terminal cysteine－rich domain，Cys－1）对应不同的 DKK 基因，且每个富含半胱氨酸区域的羧基末端（the carboxyl－terminal cysteine－rich domain，Cys－2）是DKK家族成员中最保守的区域。所有的DKK基因都拥有数个可被蛋白酶水解的位点，可能与翻译后修饰有关。DKK是经典Wnt信号通路的抑制因子，分泌蛋白Wnt与表面受体Frizzled结合，通过β－catenin（连环蛋白）的降解复合体阻断β－catenin的降解途径，促使β－catenin进入细胞核与T细胞集合，从而启动多种靶基因表达。此外，Wnt发生作用还需要低密度脂蛋白受体相关蛋白－LRP5／LRP6的参与，而DKK－1能够与LRP5／LRP6、Kremen1／2形成三聚体，通过诱导快速的细胞内吞功能，减少细胞膜上的LRP5／LRP6，从而阻断 Wnt信号向胞内传递。Ellwanger等［1］研究显示，Krem1和 Krem2对DKK－1相关功能的发挥不是普遍存在的，即DKK－1可不连接 Krem1和Krem2而发挥拮抗Wnt信号通路的活性。

DKK－1是DKK家族中研究最多的基因。人DKK－1基因由266个氨基酸残基的蛋白质组成，相对分子质量约29k，糖基化形式的DKK－1分子质量约35k。DKK－1拮抗 Wnt信号通路有2种机制［4］：一种是 DKK－1连接到 Wnt共受体－LRP5／LRP6和卷曲蛋白Kremen1和Kremen2，形成一个三元复合物，从而引起内吞，并将LRP5／LRP6移出浆膜，导致LRP5／LRP6将不能与Wnt配体和跨膜受体结合，阻止信号受体复合物的形成，最终抑制细胞外Wnt信号的活化。另一种是DKK－1与LRP6连接并隔离它，Wnt引导的卷曲蛋白LRP6复合体形成受阻。

2 DKK－1与肿瘤的关系

在许多肿瘤中 Wnt通路过度活化，DKK－1作为经典Wnt通路抑制物也受到重视，对其研究日益增多。研究［2］显示：DKK－1具有复杂的功能，在不同肿瘤中的作用亦有差异。Liu等［3］对11篇（原发性肝癌4篇，卵巢癌、食管癌和肺癌各2篇，多种肿瘤1篇）关于DKK－1高表达的实体肿瘤的meta分析发现，DKK－1水平越高，患者总生存期及无病生存期就越短。DKK－1有可能作为亚洲人实体肿瘤患者的预后指标。

2.1 DKK－1与肝癌及胆管细胞癌

研究报道DKK－1在肝细胞癌细胞株及组织中高表达。Yu等［4］首次报道了肝细胞癌的DKK－1的高表达与胞浆／胞核中β－catenin聚集有关。一项纳入831例的大样本研究［5］分析显示，肝细胞癌患者血清DKK－1明显高于其他对照组（慢性乙肝病毒感染、肝硬化、健康对照），血清DKK－1浓度的高低，可以将肝细胞癌从乙肝病毒感染者、肝硬化患者和健康人中区分出来。DKK－1结合AFP诊断肝细胞癌的准确性明显高于任一项单独诊断，由此推测，DKK－1能补充AFP诊断肝细胞癌的不足。Tung等［6］对该831例大样本研究进行了详细分析，也赞同DKK－1对肝癌诊断具有重要的作用。

生存分析［7］表明，肝细胞癌的 DKK－1表达越高，其预后越差。此外，DKK－1被证实为肝细胞癌患者总生存期及无病生存期的独立预后指标。肝细胞癌患者5年总生存期和无病生存率高的患者其DKK－1表达（43.4%和34.2%）明显低于5年总生存期和无病生存率低的患者的DKK－1表达水平（59.3%和55.2%）。尽管AFP升高仍然是肝细胞癌诊断的金标准，但是一部分肝细胞癌患者AFP在正常范围，对AFP正常的肝细胞癌患者进行分组，DKK－1水平越高其预后越差，表明DKK－1可作为AFP正常的肝细胞癌患者的预后指标。同时，肝细胞癌患者DKK－1和β－catenin水平高者预后也差。不表达DKK－1和β－catenin的肝细胞癌患者的5年生存期和无病生存率分别为66.0%和59.8%，而DKK－1和β－catenin高表达患者则分别为46.0%和18.0%［8］。上述研究表明，DKK－1在肝细胞癌患者Wnt／β－catenin信号通路中起到了非常重要的作用。

DKK－1在肝细胞癌组织及血清中均高表达，同时还有作为肝细胞癌患者预后指标的潜力。DKK－1与肝细胞癌侵袭力方面的研究也有报道，Tao等［9］对肝癌细胞侵袭力研究发现：DKK－1在肝癌细胞组织，尤其是有血管浸润的组织中表达显著增加。此外，DKK－1高表达与多个淋巴结及静脉浸润有关。研究还表明，DKK－1在体内和体外均可以提高肝癌细胞的侵袭力和转移力；DKK－1提高侵袭力和非侵袭力是通过非经典Wnt信号通路完成的。

DKK－1在胆管细胞癌中也有研究报道，Shi等［10］检测了胆管细胞癌组织（133例）及血清（37例）中的DKK－1水平，发现患者的DKK－1水平与总生存期及复发时间呈负相关；胆管细胞癌组织中高水平的DKK－1与肝门淋巴结转移有关，DKK－1越低，癌细胞迁移及侵袭力越弱。由此推测，DKK－1是判断胆管细胞癌预后的新指标，它能提高肿瘤细胞的侵袭力，促进肿瘤淋巴结转移，DKK－1有可能作为胆管细胞癌治疗的新靶点。

2.2 DKK－1与肺癌

闫红红［11］通过分子克隆技术构建DKK－1的真核细胞表达载体，并筛选建立稳定转染DKK－1表达载体的肺癌细胞株，发现转染后的人肺癌细胞株95－C迁移及侵袭能力明显增强，该结果提示：DKK－1可能与肺癌的侵袭、转移有关。

Chu等［12］对非小细胞肺癌患者存在骨转移及无骨转移的患者进行研究发现，后者血清DKK－1水平明显高于前者，肺癌细胞源性DKK－1能有效抑制成骨细胞的分化、决定碱性磷酸酶的活性和骨钙素的分泌，结果表明，DKK基因在肺癌患者血清及肿瘤组织中都有表达，且存在某种相关性。Sheng等［13］测定血清DKK－1水平，结果发现肺癌患者血清DKK－1浓度比其他恶性肿瘤、肺部良性病变及健康对照组都高，且胃癌、结肠癌、卵巢癌和宫颈癌患者血清DKK－1浓度远远低于健康对照组。此外还发现，血清DKK－1水平结合细胞角蛋白片段水平或NSE水平均能提高小细胞肺癌患者诊断的敏感性。Yamabuki等［14］也测定血清DKK－1水平，同时还用免疫组化法检测肿瘤组织DKK－1的表达情况，发现非小细胞肺癌患者血清DKK－1水平越高，预后越差。此外，DKK－1结合ProGRP可提高小细胞肺癌诊断的敏感性，认为DKK－1可作为一种新的肺癌临床诊断或预后的指标，也有可能成为肺癌治疗的新靶点。以上二者的观点大致相同，都认为DKK－1有作为血清标志物的潜能。同时，当它结合其他血清标志物时，都能提高肺癌临床诊断的敏感性，表明DKK－1有成为一种无创性的临床诊断肺癌或判断预后的血清标志物的潜能。此外，Li等［15］通过RTPCR （reverse transcription－polymerase chain reaction，反转录酶－聚合酶联锁反应）和 Westen blot（蛋白印迹试验）等技术检测了10种人的小细胞肺癌细胞株和小细胞肺癌组织中DKK－1的表达，发现非小细胞肺癌组织中DKK－1mRNA和蛋白水平均比临近肺组织高；免疫组织化学和免疫荧光技术发现DKK－1主要分布在癌细胞组织和细胞株的细胞浆中；DKK－1对癌细胞增殖没有影响，但可能在癌细胞迁移和侵袭力方面有一定的作用；认为DKK－1可能是非小细胞肺癌发展的重要调节因子，推测DKK－1可作为非小细胞肺癌潜在的治疗靶点。

2.3 DKK－1与其他肿瘤

多发性骨髓瘤以破骨细胞活性增加，成骨活细胞性降低为特征，其中骨病仍然是一个有待解决的主要问题。已有研究［16］证实，Wnt信号通路是骨骼形成以及维持骨骼内稳态的重要信号通路。DKK－1能破坏成骨细胞的分化和活性，从而阻止新生骨骼的形成。在多发性骨髓瘤中，DKK－1由多发性骨髓瘤细胞产生，尤其在广泛骨浸润的骨髓瘤微环境中高表达。研究［17］报道，多发性骨髓瘤患者血清中DKK－1高表达；Pozzi等［18］报道，DKK－1在多发性骨髓瘤患者血浆中高表达，其水平与国际通用的肿瘤分期、分级和有无溶骨性改变相关。笔者同时对鼠多发性骨髓瘤模型进行研究，发现使用抗－DKK－1中和抗体能明显增加成骨细胞的数量，同时减少多核破骨细胞的数量和增加骨量，由此可推测，抗－DKK－1中和抗体与骨髓瘤细胞负荷相关，即抗－DKK－1抗体能间接抑制骨髓瘤细胞的破骨作用。DKK－1有望作为多发性骨髓瘤及其骨相关疾病的治疗靶点，持续的临床研究将有助于阐明其有效性。Qian等［19］研究发现DKK1－DNA疫苗能够有效抑制骨髓瘤小鼠模型的进一步发展和治疗骨髓瘤，由此推测DKK－1可用于制作骨髓瘤免疫治疗的新疫苗。Pozzi和Qian等的研究都在多发性骨髓瘤的治疗方面提出了新思路，为多发性骨髓瘤患者的临床免疫治疗提供了一个很好的基本理论和平台。

Ogoshi等［20］研究口腔鳞状细胞癌DKK－1水平时发现，口腔鳞癌细胞株及原发性口腔鳞癌患者组织中的DKK－1明显高于正常患者；DKK－1阳性病例与低风险的区域淋巴结转移有相关性；细胞经敲除DKK－1基因后，其细胞迁移及侵袭能力明显高于DKK－1基因过表达者，这与DKK－1在其他肿瘤对细胞迁移及侵袭力方面的作用相反。该研究证实，DKK－1在调节细胞迁移和侵袭力方面具有重要作用，可作为口腔鳞癌早期淋巴结转移的潜在标志物。

DKK－1在消化系统肿瘤中的研究。Li等［21］通过RT－PCR技术及 Western blot检测食管癌患者的DKK－1mRNA及DKK－1蛋白表达，结果发现：二者在食管癌组织中的表达高于癌旁组织中的表达。此外，DKK－1的高表达增加了食管癌细胞的侵袭力，同时证实了DKK－1是食管癌进展的重要调节因子，它还可以作为食管癌治疗的潜在靶点。Ssto等［22］对DKKs基因在胃肠道肿瘤中的表达及甲基化情况进行研究，发现DKK－1基因在结直肠癌组织中33%沉默，DKK－1基因甲基化表达在胃癌细胞系达38%，略低于肝细胞癌系及前列腺癌细胞系。Lee等［23］对胃癌患者组织及血清DKK－1表达进行研究发现，胃癌组血清DKK－1浓度明显高于健康对照组（P＜0.001），肿瘤组织中DKK－1高表达与血清DKK－1高浓度具有相关性。血清及组织中DKK－1水平可协助诊断胃癌和判断胃癌患者预后。在结直肠癌中，Soydinc等［24］通过ELISA方法对135例结肠癌、160例直肠癌及90例正常对照者血清中DKK－1水平进行分析，发现DKK－1水平在三者中差异无统计学意义；同时发现，血清DKK－1水平尚无作为诊断结直肠癌患者的潜力。

Chen等［25］通过免疫组织化学方法研究DKK－1基因在恶性黑色素瘤组织中的表达发现，DKK－1较正常皮肤表达低，DKK－1基因表达能抑制恶性黑色素瘤细胞的侵袭活性。

DKK－1在多种肿瘤中均有表达，如宫颈癌［26］、激素抵抗型乳腺癌、肾癌和卵巢癌等。DKK－1可作为乳腺癌诊断的潜在指标，对预后判断也有一定的价值。

3 结语与展望

综上所述，DKK－1在多种肿瘤的发生、发展中通过不同的机制扮演着重要的角色。在不同的恶性肿瘤中DKK－1的表达或高或低，对恶性肿瘤的诊断具有一定的价值，也与大多数肿瘤的侵袭与转移相关，但与肿瘤细胞增殖无关，是诊断潜在的恶性肿瘤的新指标之一，也可能是恶性肿瘤潜在的治疗靶点之一。但许多研究仍然停留在基础研究阶段，在临床应用方面的研究有待进一步推进，比如医学影像诊断技术联合DKK－1在恶性肿瘤诊断方面的价值等。DKK－1在肿瘤中的进一步研究有利于对不同肿瘤的发生、发展和转移机制有更深入的了解，也可为临床诊断及治疗提供更可靠的依据。

［1］Ellwanger K，Saito H，Clément－Lacroix P，et al.Targeted Disruption of the Wnt regulator Kremen induces limb defects and high bone density ［J］.Mol Cell Biol，2008，28（15）：4875－4882.

［2］Menezes ME，Devine DJ，Shevde LA，et al.Dickkopf 1：A tumor suppressor or metastasis promoter［J］.Int J Cancer，2012，130（7）：1477－1483.

［3］Liu Y，Tang W，Xie L，et al.Prognostic significance of dickkopf－1overexpression in solid tumors：a meta－analysis［J］.Tumour Biol，2014，35（4）：3145－3154.

［4］Yu B，Yang X，Xu Y，et al.Elevated expression of DKK1is associated with cytoplasmic ／nuclear beta－catenin accumulation and poor prognosis in hepatocellular carcinomas［J］.J Hepatol，2009，50（5）：948－957.

［5］Shen Q，Fan J，Yang XR，et al.Serum DKK1as a protein biomarker for the diagnosis of hepatocellular carcinoma：a large－scale，multicentre study［J］.Lancet Oncol，2012，13（8）：817－826.

［6］Tung EK，Ng IO.Significance of serum DKK1as a diagnostic biomarker in hepatocellular carcinoma ［J］.Future Oncol，2012，8（12）：1525－1528.

［7］Yang H，Chen GD，Fang F，et al.Dickkopf－1：as a diagnostic and prognostic serum marker for early hepatocellular carcinoma［J］.Int J Biol Markers，2013，28（3）：286－297.

［8］Fatima S，Lee NP，Luk JM.Dickkopfs and Wnt／β－catenin signaling in liver cancer［J］.World J Clin Oncol，2011，2（8）：311－325.

［9］Tao YM，Liu Z，Liu HL.Dickkopf－1（DKK1）promotes invasion and metastasis of hepatocellular carcinoma［J］.Dig Liver Dis，2013，45（3）：251－257.

［10］Shi RY，Yang XR，Shen QJ，et al.High expression of Dickkopf－related protein 1is related to lymphatic metastasis and indicates poor prognosis in intrahepatic cholangiocarcinoma patients after surgery［J］.Cancer，2013，119（5）：993－1003.

［11］闫红红.DKK1基因在肺癌细胞系中表达及其生物学功能的研究 ［D］.石家庄：河北医科大学，2012.

［12］Chu T，Teng J，Jiang L，et al.Lung cancer－derived Dickkopf1 is associated with bone metastasis and the mechanism involves the inhibition of osteoblast differentiation ［J］.Biochem Biophys Res Commun，2014，443（3）：962－968.

［13］Sheng SL，Huang G，Yu B，et al.Clinical significance and prognostic value of serum dickkopf－1concentrations in patients with lung cancer ［J］.Clin Chem，2009，55（9）：1656－1664.

［14］Yamabuki T，Takano A，Hayama S，et al.Dikkopf－1as a novel serologic and prognostic biomarker for lung and esophageal carcinomas ［J］.Cancer Res，2007，67（6）：2517－2525.

［15］Li S，Qin X，Guo X，et al.Dickkopf－1is oncogenic and involved in invasive growth in non small cell lung cancer［J］.PloS One，2013，8（12）：e84944.

［16］Cai Y，Cai T，Chen Y.Wnt pathway in osteosarcoma，from oncogenic to therapeutic［J］.J Cell Biochem，2014，115（4）：625－631.

［17］Bao L，Huang XJ.Measurement and clinical significance of serum DKK－1and sRANKL levels in multiple myeloma［J］.Zhonghua Nei Ke Za Zhi，2011，50（3）：243－247.

［18］Pozzi S，Fulciniti M，Yan H，et al.In vivo and in vitro effects of a novel anti－DKK1neutralizing antibody in multiple myeloma［J］.Bone，2013，53（2）：487－496.

［19］Qian J，Yi Q.DKK1as a novel target for myeloma immunotherapy［J］.Oncoimmunology，2012，1（5）：756－758.

［20］Ogoshi K，Kasamatsu A，Lyoda M，et al.Dickkopf－1in human oral cancer［J］.Int J Oncol，2011，39（2）：329－336.

［21］Li S，Qin X，Liu B，et al.Dickkopf－1is involved in invasive growth of esophageal cancer cells［J］.J Mol Histol，2011，42（6）：491－498.

［22］Ssto H，Suzuki H，Toyota M，et al.Frequent epigentic inactivation of DICKKOPF family genes in human gastrointestinal tumors［J］.Carcinogenesis，2007，28（12）：2459－2466.

［23］Lee HS，Lee HE，Park do J，et al.Clinical significance of serum and tissue Dickkopf－1levels in patients with gastric cancer［J］.Clin Chim Acta，2012，413（21－22）：1753－1760.

［24］Soydinc HO，Duranyildiz D，Camlica H，et al.Lack of diagnostic potential of Dickkopf－1in colon and rectum cancers［J］.Asian Pac J Cancer Prev，2011，12（12）：3187－3189.

［25］Chen J，Li H，Chen H，et al.Dickkopf－1inhibits the invasive activity of melanoma cells ［J］.Clin Exp Dermatol，2012，37（4）：404－410.

［26］Jiang T，Huang L，Zhang S.Dickkopf－1in serum as a clinical and prognostic factor in patients with cervical cancer［J］.Int Biol Markers，2013，28（2）：221－225.