僵蚕乙醇提取物对HearNPV的增效作用研究

张瑞凤，马 贺，赵思楠，牛敏敏，邢莹莹，王 敦

(西北农林科技大学 旱区作物逆境生物学国家重点实验室, 陕西 杨凌 712100)

僵蚕 (Bombyxbatryticatus)是蚕蛾科(Bombycidae)昆虫家蚕(Bombyxmori)幼虫感染白僵菌(Beauveriabassiana(Bals.) Vuill.) 后僵死的干燥全虫，始载于《神农本草经》，具有退热、止咳、化痰、镇静、镇惊、消肿等功效，可用于癫痫、高热惊厥、流行性腮腺炎、上呼吸道感染、遗尿等症的治疗[1-2]。现代药理研究发现，僵蚕具有抗惊厥、抗感染、抑瘤、降血糖和降血脂等作用[3-5]。曹军等[6]还发现，僵蚕乙醇提取物对棉铃虫幼虫具有很强的胃毒作用，且其杀虫作用与试虫中肠碱性磷酸酶(ALP)活性被抑制有关。

害虫中肠的ALP是Bt毒素蛋白结合至中肠的靶点之一，在Bt毒素蛋白对昆虫中肠围食膜结构造成破坏的过程中发挥着重要作用[7]。众所周知，昆虫病毒作为专一性非常强的病原微生物，其对昆虫的感染均通过突破昆虫中肠防御而实现，侵染效率高低与宿主昆虫中肠的防御功能密切相关。HearNPV感染棉铃虫的过程中，病毒成功感染后即对宿主ALP基因的表达及ALP的活性产生明显抑制，从而利于病毒的进一步侵染和增殖[8]。基于僵蚕乙醇提取物对ALP的抑制作用，尝试利用僵蚕乙醇提取物来降低害虫中肠防御能力、提高病毒毒力。为此，本研究将僵蚕乙醇提取物添加到病毒制剂中，分析其在病毒感染棉铃虫过程中的增效作用，以期为今后深入研究生物源病毒增效剂和研发相关增效剂产品提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 病毒与试虫

棉铃虫核型多角体病毒(HearNPV)由西北农林科技大学植物保护学院分子病毒学实验室提供。棉铃虫(H.armigera)购自河南省济源白云实业有限公司。

1.2 僵蚕及其提取物

僵蚕(产地：江苏)购自西安药材公司，将僵蚕拣选除杂，然后置于60 ℃干燥箱中恒温干燥8 h，取出后粉碎过筛(孔径0.25 mm)，混合均匀，称量，备用。体积分数95%乙醇僵蚕乙醇提取物(简称BB extract)采用冷浸提取法提取，提取过程均保持常温常压条件，具体步骤参考曹军等[6]的方法，制备的浸膏干燥后溶解于丙酮中作为后续生测的母液。

1.3 生物测定

在HearNPV病毒悬浮液(5×105PIB/mL)中分别添加质量浓度为20，40，60和80 μg/mL的僵蚕乙醇提取物，添加浓度均低于亚致死质量浓度 0.5 mg/mL[6]；以相同滴度病毒悬浮液中加等体积的僵蚕乙醇提取物溶剂(丙酮和无菌水)为对照CK。每个质量浓度处理重复3次，每处理60头3龄棉铃虫，即每个质量浓度计180只试虫，共计900只试虫。挑选大小接近、2龄末期蜕皮后的棉铃虫饥饿12 h，分别用滴加2 μL不同处理病毒悬浮液的饲料块(约2 mm3)喂食。待完全取食后，补充新鲜的无毒人工饲料喂养；剔除未完全取食给毒饲料块的试虫，确保试验组每重复有效试虫达50只。逐日统计死亡率，试验结束后计算各组的LT50和LT90。

1.4 ALP活性测定

1.3节中各处理组幼虫取食完全带毒饲料换为新鲜无毒饲料后，即按感染后计时。在感染病毒后12，24 h分别随机取试虫10只，取出中肠后冰浴匀浆，制备粗酶液用于测定ALP活性，具体操作参照于欢等[8]的方法进行。按不同处理组且每组3个重复分别求出每个单独处理的ALP活性，最后计算不同处理组的平均值。

1.5 数据分析

所有测定数据应用DPS软件[9]进行分析，计算校对死亡率和LT50、LT90值，并进行差异显著性检验。

2 结果与分析

2.1 HearNPV添加僵蚕乙醇提取物对棉铃虫致死率的影响

由表1可以看出，试虫感染HearNPV病毒后第4天，僵蚕乙醇提取物的质量浓度达到40 μg/mL，即可产生显著的增效作用，试虫的校正死亡率超过20%。从HearNPV病毒感染试虫第5天起，20 μg/mL的僵蚕乙醇提取物即表现出明显的增效作用，导致试虫的校正死亡率超过50%，与CK相比差异显著(P≤0.05)；当僵蚕乙醇提取物的质量浓度高于40 μg/mL，饲毒第5天导致试虫的校正死亡率上升至60%以上，与CK相比差异极显著(P≤0.01)。在HearNPV病毒感染试虫第6天，添加40～80 μg/mL僵蚕乙醇提取物均可使试虫的校正死亡率达90%以上，而CK的死亡率只有67.9%，差异均达极显著水平(P≤0.01)；感染HearNPV病毒第7天，除对照外，所有僵蚕乙醇提取物剂量都能够使试虫死亡率达到90%以上，而对照的死亡率只有85.7%，表明僵蚕乙醇提取物对HearNPV具有显著的增效作用。

表1 僵蚕乙醇提取物对HearNPV的增效作用

2.2 HearNPV添加僵蚕乙醇提取物对棉铃虫致死时间的影响

为了进一步明确僵蚕乙醇提取物对棉铃虫核型多角体病毒的增效作用，本研究分析了僵蚕乙醇提取物对HearNPV LT50、LT90的影响。表2显示，与对照相比，在各僵蚕乙醇提取物添加组，HearNPV病毒对试虫的毒力均有所提高，LT50值与CK相比存在显著差异，20 μg/mL剂量组的LT50值较对照缩短16.1%，最高剂量80 μg/mL的LT50较对照缩短了23.2%。僵蚕乙醇提取物添加组的LT90值与对照HearNPV病毒组相比差距进一步加大，60和80 μg/mL剂量组的LT90值较对照缩短了27.8%，差异达极显著水平(P≤0.01)。以上结果表明，僵蚕乙醇提取物能够显著缩短HearNPV病毒的LT50和LT90值，对HearNPV有极显著的增效作用(P≤0.01)。

表2 僵蚕乙醇提取物对HearNPV LT50和LT90的影响

2.3 HearNPV添加僵蚕乙醇提取物对棉铃虫ALP活性的影响

从图1可知，棉铃虫感染HearNPV后12 h，与CK相比，添加40 μg/mL的僵蚕乙醇提取物可导致试虫中肠ALP活性显著下降(P<0.05)，随着僵蚕乙醇提取物剂量的增加，ALP活性下降程度加剧，在80 μg/mL剂量下ALP活性较CK极显著下降(P<0.01)。

图1 僵蚕提取物与HearNPV共同作用对棉铃虫ALP活性的影响

图1显示，在试虫感染HearNPV后24 h，与CK相比，僵蚕乙醇提取物添加组ALP活性均显著下降(P<0.05)，40 μg/mL以上的剂量导致试虫中肠ALP活性极显著下降(P<0.01)。说明棉铃虫在受HearNPV感染过程中，添加僵蚕乙醇提取物能够显著降低试虫中肠的ALP活性，且ALP活性的降低程度随感染时间的延长进一步加大。

3 结论与讨论

3.1 结 论

在HearNPV病毒悬浮液浓度为5×105PIB/mL 时，僵蚕乙醇提取物对棉铃虫核型多角体病毒具有显著的增效作用，能够显著提高病毒的毒力，40 μg/mL的剂量水平就能使病毒感染试虫第6天的死亡率达到90%，第7天的死亡率达到100%。

本研究表明，20 μg/mL剂量的僵蚕乙醇提取物就能够显著提高HearNPV病毒的毒力、缩短病毒对棉铃虫的致死时间， 其LT50和LT90值分别较对照缩短16.1%和20.3%；在80 μg/mL的剂量水平下，LT50和LT90值分别较对照缩短23.2%和27.8%，说明僵蚕乙醇提取物能够显著缩短病毒对害虫的致死时间。

棉铃虫在受病原病毒感染过程中，添加僵蚕乙醇提取物能够显著降低试虫中肠ALP的活性，40 μg/mL以上的剂量可导致试虫中肠ALP活性较对照极显著下降，且ALP活性的降低程度随感染时间的延长进一步加大。僵蚕乙醇提取物对HearNPV的增效作用与其对棉铃虫中肠ALP活性的抑制作用一致，说明僵蚕乙醇提取物对HearNPV的增效作用机理可能与其对试虫中肠ALP活性的抑制作用相关，但确切作用途径还有待进一步研究。

3.2 讨 论

杆状病毒在害虫生物防治中的应用始于20世纪40年代[10]，目前已经有20余种杆状病毒应用于农林害虫生物防治[11-12]。昆虫病毒作为生物杀虫剂，能在害虫种群中形成流行病而长期控制虫口密度，因而昆虫病毒杀虫剂已经受到人们越来越多的关注。然而，病毒杀虫剂的应用也存在一些弊端，最主要的是作用速度较慢、杀虫效率较低，这大大束缚了病毒杀虫剂的大面积生产应用[11]。为此，如何通过增效剂的作用来提高天然昆虫病毒的杀虫效率成为昆虫病毒研究的一个热点。对于昆虫病毒增效剂的研究，包括生物增效剂和化学增效剂两个方面，但主要集中在生物增效剂中的病毒增强素及化学增效剂中的荧光增白剂上[13]。荧光增白剂等化学增效剂和化学农药一样，存在环境污染的弊端，从而使其研发和使用受到限制，因此生物增效剂的研究近年来颇受关注[14-17]，包括来源于病毒自身的基因[18]、微生物多肽[19]等。本研究以僵蚕为对象，研究了其对昆虫病毒的增效作用，与前人报道过的生物增效剂相比，僵蚕乙醇提取物与几丁质酶的增效作用类似，均能够缩短病毒感染试虫的致死时间，但在增效作用强度上略有不同：病毒感染后第5天，60 μg/mL 剂量的僵蚕乙醇提取物可导致棉铃虫的校正死亡率高达67.9%；而以病毒来源的几丁质酶[18]和细菌来源的几丁质酶[19]作为增效剂时，病毒感染后第5天棉铃虫的校正死亡率仅分别为49.4%和 48.6%，说明僵蚕乙醇提取物的增效作用与其他生物增效剂相比具有一定优势。尽管其作用机理尚不明确，但从ALP活性数据可以推测，僵蚕乙醇提取物的增效作用与其对试虫中肠ALP活性的抑制作用相关。由于ALP是昆虫中肠围食膜上Bt毒素蛋白的作用靶标之一，在Bt毒素蛋白对昆虫中肠围食膜结构造成破坏的过程中发挥着重要作用[7]，因此僵蚕乙醇提取物对试虫中肠ALP活性的抑制作用可能会导致害虫中肠防御功能的削弱，从而提高病毒侵染的效率。

对于杆状病毒而言，达到90%的死亡率通常需要7 d以上的时间，导致杆状病毒使用受到一定的限制。本研究结果证明，僵蚕乙醇提取物能够显著缩短病毒对害虫的致死时间，这无疑对提高病毒的防治效果、最大程度地挽回经济损失及促进昆虫病毒的生物防治应用具有重要的意义。同时，其也为将僵蚕作为病毒增效剂新材料提供了可能。

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