多粘类芽孢杆菌PS04胞外多糖分子结构研究

蹇华丽，田文祥，杨幼慧，廖美德

（1.华南农业大学食品学院，广东广州510642；2.佛山市一方制药股份有限公司，广东佛山528244；3.华南农业大学资源与环境学院，广东广州510642）

多粘类芽孢杆菌PS04胞外多糖分子结构研究

蹇华丽1，田文祥2，杨幼慧1，廖美德3，*

（1.华南农业大学食品学院，广东广州510642；2.佛山市一方制药股份有限公司，广东佛山528244；3.华南农业大学资源与环境学院，广东广州510642）

采用丙烯葡聚糖凝胶S-200 HR对PS04多糖进行过滤层析，得到单一组分峰，且通过凝胶渗透色谱法分析测定，可知该多糖重均分子量为4009ku，峰位分子量为3174ku，分布宽度指数为1.348；结合红外光谱、高效液相色谱及核磁共振分析，确定该多糖由果糖与葡萄糖以7∶1的比例组成，在多糖结构中，果糖残基以呋喃环构型存在，且以β-2，6、β-1，2键连接，因PS04多糖与果聚糖最为接近，可初步判断该多糖是一种果聚糖。

多粘类芽孢杆菌，胞外多糖，结构鉴定

微生物多糖具有独特的理化性质及生物活性，因其具有生产过程可控性高、不受天气季节影响、生产周期短等优势而被大量生产且广泛应用于各行各业[1-2]。到目前为止，已大量投产的微生物多糖主要有黄原胶、右旋糖苷、结冷胶、普鲁兰多糖、小核葡聚糖等。多糖的化学结构是其生物活性的基础[3-4]，其结构研究首先要使用多种提取分离、纯化鉴定手段获得均一的多糖组分，然后测定均一性多糖组分的理化性质，最后采用化学分析法、光谱分析法、生化分析方法等手段进行结构测定[5-6]。完整的多糖结构测定应包括对多糖的一级结构和高级结构的分析，但由于测定多糖高级结构非常困难，目前关于多糖结构的报道，大多处于测定一级结构的层次[7-8]。

从华南农业大学杀虫植物园土壤中分离筛选得到一株可以分泌大量粘性多糖的菌株PS04，经鉴定该菌株属于多粘类芽孢杆菌，通过优化其发酵条件，多糖产量可高达60.04g/L；对其多糖粘度性质进行初步研究，发现其具有假塑性、低浓度下高粘性，同时对热及酸碱有较好的稳定性[9-10]。本实验将对该多糖分子结构进行研究，为其应用开发奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

菌株PS04 从华南农业大学杀虫植物园土壤中分离得到，接种于察氏斜面培养基，在30℃培养48h后保存菌种；葡萄糖、果糖、乙腈（色谱纯） 美国Fisher公司；溴化钾（光谱纯） 德国Merck公司；其余培养基制备及多糖提取、检测试剂 均为国产分析纯。

AVATAR 360 FT-IR型傅立叶变换红外光谱仪美国Nicolet公司；DRX-600核磁共振仪 德国-瑞士Bruker公司；H-CLASS高效液相色谱 美国Waters公司；CHRIST ALPHA 1-4/2-4 LSC型冻干机 德国Marin Christ公司；U-3010紫外可见分光光度计 日本Hitachi公司。

1.2 培养基和培养条件

蔗糖30g、NaNO33g、KH2PO4·3H2O 1g、KCl 0.5g、MgSO4·7H2O 0.5g、FeSO4·7H2O 0.01g、蒸馏水1000mL，自然pH；接种量1%（v/v），装液系数（装液体积与容器体积之比）0.4，37℃，150r/min摇床培养48h。

1.3 多糖提取与纯化

PS04菌株发酵液100℃水浴加热30min，蒸馏水稀释两倍，冷却，8000r/min离心15min，取上清液，以3∶1（v/v）用量加入95%乙醇，沉淀；将沉淀得到的多糖复溶于蒸馏水中，用Sevage法除蛋白，配制氯仿：正丁醇=5∶1（V∶V）二元体系，按照1∶5（V溶剂∶V发酵液）的比例加入到PS04多糖提取液中，混合、剧烈振荡，静置分层后去除溶剂层和与水层交接处的蛋白质，再继续加入上述比例的有机溶剂，直至交界处没有变性蛋白产生为止。得到的水相溶液经24h透析，冻干，得PS04精制多糖样品。

1.4 多糖结构鉴定

1.4.1 丙烯葡聚糖凝胶S-200 HR过滤层析 称取10mgPS04精制多糖样品溶于1mL水中，利用Sephacryl S-200HR层析柱（1.5cm×60cm），蒸馏水洗脱，洗脱流速1mL/min，分部收集，苯酚-硫酸法检测糖分布[11]。

1.4.2 多糖分子量测定 采用凝胶渗透色谱法（GPC）测定[11]。柱子：TSK-GEL保护柱PWXL 6.0×40（mm）、TSK-GEL4000KpwxL 7.8×300（mm）和TSKGEL2500K pwxL 7.8×300（mm）；检测器：waters2414示差折光检测器；洗脱剂：0.2mol/L KH2PO4；流速：0.6mL/min；柱温：35℃。以一系列分子量的葡聚糖为标准品，加洗脱剂配制成2mg/L的标准溶液，测定并绘制标准曲线。然后配制2mg/L PS04精制多糖溶液，测定后通过标准曲线计算样品分子量。

1.4.3 单糖组分分析 称取5mg PS04精制多糖样品，加入2mL 2mol/L三氟乙酸，安培封管100℃水解6h，冷却、旋转蒸发至干，加入2mL超纯水溶解，旋转蒸发至干，重复2次。加入2mL超纯水溶解，用0.22μm膜过滤，得澄清浓缩液，置冰箱冷藏备用[12]。高效液相色谱（HPLC）分析条件：Asahipak NH2P-50G 4A色谱柱，Alltech蒸发光检测器，进样量10μL，流动相为乙腈∶水=85∶15（V/V），流速1mL/min[13]。

1.4.4 红外光谱分析 取干燥PS04精制多糖样品2mg，压片，用傅立叶变换红外光谱仪在4000～400cm-1范围内作全波长扫描[14]。

1.4.5 核磁共振分析 取干燥的PS04精制多糖10mg，溶解于0.5mL D2O中。用600M核磁共振仪进行分析。

2 结果与分析

2.1 丙烯葡聚糖凝胶S-200 HR过滤层析

将PS04精制多糖样品采用Sephacryl S-200HR层析柱分离，分部收集液用苯酚-硫酸法检测糖分布，实验结果如图1所示，洗脱峰为单一对称的狭窄峰，表明PS04多糖样品为分子量均一的多糖。

图1 PS04多糖Sephacryl S-200HR柱层析洗脱曲线Fig.1 Elution profile of PS04 polysaccharide on Sephacryl S-200HR column

2.2 PS04多糖分子量测定

多糖分子大小分布呈分散性，其分子量大小表现为连续的变化，所以多糖的分子量大小一般是指它在一定范围的平均值。通过凝胶渗透色谱法（GPC）测定PS04多糖分子量，可知其重均分子量为4009ku，峰位分子量为3174ku，分布宽度指数1.348。结果表明PS04多糖分子量分布较为集中，可认为该多糖为均一的多糖。分子量不仅影响多糖溶液流变性质，也影响一些活性多糖的生理活性。Calazans等[3]在研究运动发酵单胞菌果聚糖的分子量与抗肿瘤活性关系实验中发现重均分子量为456.9ku的果聚糖活性最好，720.2、1073.5ku的次之，353.5ku的果聚糖活性最差。PS04多糖的分子量较大，其生理活性还有待于进一步研究。

图2 PS04多糖的重均分子量图谱Fig.2 The weight mean molecular weight of the PS04 polysaccharide

2.3 PS04多糖的单糖组分分析

如图3和图4所示，PS04多糖完全水解后经HPLC检测发现有两种单糖存在，与标准单糖的HPLC图谱比较，确定为果糖和葡萄糖。利用标准曲线计算两种单糖含量可知果糖∶葡萄糖=7∶1。

2.4 PS04多糖红外光谱分析

PS04多糖红外光谱分析结果（图5）表明其具有典型多糖的吸收峰。3392.01cm-1为O-H的伸缩振动（其低于3400cm-1表明存在分子内氢键）。2937.23cm-1与2886.82cm-1为C-H不对称伸缩振动，而1454.62cm-1与1420.10cm-1形成的双峰为C-H的变角振动[14]。1775～ 1727cm-1不存在红外吸收峰，则表明不存在乙酰基与酯基。1637.39cm-1处吸收峰表明有结合水存在。1159.68cm-1和1227.63cm-1为C-O（C-O-C和C-O-H）的伸缩振动。1063.20cm-1和1016.46cm-1形成的双峰为O-H变角振动。927.55cm-1是呋喃环伸缩振动造成的，而812.85cm-1是呋喃环的C-H变角振动，说明该多糖结构中存在呋喃糖环。由此可见，PS04多糖不含有乙酰基与酯基，其中糖残基以呋喃型五元环存在。

图3 PS04多糖水解样品与葡萄糖HPLC的图谱Fig.3 The HPLC chromatograms of glucose and hydrolysates of PS04 polysaccharide

图4 PS04多糖水解样品与果糖HPLC的图谱Fig.4 The HPLC chromatograms of fructose and hydrolysates of PS04 polysaccharide

图5 PS04多糖的红外光谱Fig.5 The infrared spectra of PS04 polysaccharide

2.5 PS04多糖的核磁共振特征分析

2.5.1 PS04多糖的1H-NMR的图谱解析1H-NMR主要用于分析多糖中糖苷键的构型[15]。通常α型糖苷的异头质子超过δ5.0，β型一般小于δ5.0。PS04多糖溶于D2O中，测定其1H-NMR谱（图6）。谱图中没有化学位移超过δ5.0，故确定PS04多糖是β型糖苷键构型。多糖的主链糖苷键构型在多糖活性中起一定作用，香菇多糖（β构型）与淀粉（α构型）的主链构型不同，这可能是导致两者活性上存在差异的重要原因。对于其他类型的多糖，具有生物活性者也多是β构型，因此PS04多糖链的β糖苷键构型是其可能具有生物活性的基础。

图6 PS04多糖1H-NMR图谱Fig.6 1H-NMR spectrum of PS04 polysaccharide

图7 PS04多糖13C-NMR图谱Fig.7 13C-NMR spectrum of PS04 polysaccharide

2.5.2 PS04多糖的13C-NMR的图谱解析 13C-NMR在多糖结构分析上具有很重要的地位，通过这种方法不但能够确定各种碳的位置，还能区别分子的构型和构象，它主要用于分析多糖结构中的异头碳构型以及多糖中残基的取代位置等。PS04多糖的13CNMR谱如图7所示，在90～110ppm异头碳出现的区域在104.22ppm处有明显信号，表示只有或至少有一种糖残基。结合Han及Liu等[16-17]对果聚糖的研究，对PS04多糖残基中碳原子化学位移进行初步归属，结果如表1所示。对比PS04多糖与各种果糖在C-5、C-2、C-6的化学位移发现（表1），PS04多糖C-5、C-2化学位移与呋喃糖接近，C-6处化学位移此三者（PS04多糖、呋喃糖、吡喃糖）相差不大，由此可以推测PS04多糖中糖单元为呋喃五元环结构。当多糖残基中-OH发生取代，相应碳原子化学位移会向低场区移动[18]。将PS04多糖糖残基中碳原子化学位移与β-D-呋喃果糖相比，发现只有C-2和C-6向低场区移动，因此可以确定C-2、C-6发生取代。另外，PS04多糖糖残基中碳原子化学位移与文献报道的细菌果聚糖碳原子化学位移极为相近，故推测PS04多糖主要是由β-1，2键连接D-呋喃果糖残基为主链，以少量β-2，1键形成分支点。分支度（DB）对多糖的活性有一定影响，具有生物活性的β-1，3-D-葡聚糖的DB范围很广，在0.015～0.750之间都有分布，但主要分布在0.20～0.33之间，处于该范围的多糖活性也相对更强，因此，关于PS04多糖的分支度还需进一步具体确认。在图谱中未发现葡萄糖残基的信号，可能是由于葡萄糖残基含量少而导致信号积累太少的缘故。

2.5.3 PS04多糖的HSQC图谱解析 HSQC为异核单量子相干，其反映的是直接相连的1H、13C核之间的耦合关系（1JCH）[19]。通过HSQC就可以将糖单元中氢核进行化学归属。如图8所示，A与B是由C-1上直接相连的氢原子耦合产生，故C-1上连接2个氢原子；同理C与D由C-6与其直接相连氢原子之间的耦合作用产生，表明与C-6上相连的有2个氢原子；E、F、G分别由C-4、C-3、C-5与其上连接的氢原子发生耦合作用产生，说明C-4、C-3、C-5上只连接1个氢原子；而C-2上不存在氢原子，故没有产生信号。

表1 几种糖的13C-NMR化学位移（ppm）[16-17]Table 1 Chemical shift assignments for the13C-NMR spectrum of some kinds of suger（ppm）[16-17]

图8 PS04多糖HSQC图谱Fig.8 HSQC spectrum of PS04 polysaccharide

2.5.4 PS04多糖的HMBC图谱解析 HMBC是异核多键相关，其将1H核与长程耦合的13C核关联起来，从而给出分子连接骨架的结构信息。对于多糖，它可以作为序列分析的工具对糖单元之间连接次序进行分析。从图9中可以看出，所有耦合都是由β-D-呋喃果糖残基上的碳原子与氢原子之间作用产生，其中A、B是C-2与C-1上H之间的耦合产生，C是C-2与C-6上氢原子之间耦合产生。HMBC结果进一步说明PS04多糖是由β-2，6键与β-2.1键连接而成。

3 结论

图9 PS04多糖HMBC图谱Fig.9 HMBC spectrum of PS04 polysaccharide

3.1 采用丙烯葡聚糖凝胶S-200 HR对PS04精制多糖进行纯化，且通过凝胶渗透色谱法分析测得该多糖重均分子量为4009ku，峰位分子量为3174ku，分布宽度指数为1.348，分子量分布较为集中，可认为该多糖为均一的多糖；经水解后进行HPLC分析单糖组成，发现该多糖由果糖和葡萄糖构成，其摩尔比例为7∶1；结合红外光谱及核磁共振分析，确定在PS04多糖结构中，果糖残基以呋喃环构型存在，且以β-2，6、β-1，2键连接，与相关文献中提到的各种多糖结构进行比对，PS04多糖与果聚糖最为接近，因此可初步判断该多糖是一种果聚糖。关于葡萄糖与果糖的连接方式，以及糖链分支所占比例，还需进一步开展实验。

3.2 与蛋白质、核酸相比，多糖的结构更为复杂，需要结合多种大型精密仪器，测定和分析工作量大，成本高。因实验条件所限，本研究仅对PS04多糖的一级结构作了初步分析，今后还需进行大量工作，精确测定其二级、三级甚至四级结构，进行更系统的研究，从而为深入探讨该多糖结构和功能之间的关系提供科学依据。

[1]李龙伟，闫锁．黄原胶与卡拉胶复配在果冻中的应用研究[J].现代农业科技，2009（17）：342-343.

[2]Slaveykova V I，Parthasarathy N，Dedieu K，et al.Role of extracellular compounds in Cd-sequestration relative to Cd uptake by bacterium Sinorhizobium meliloti[J].Environmental Pullution，2010，158（8）：2561-2565.

[3]Calazans G M T，Lima R C，de Franca F P，et al．Molecular weight and antitumour activity of Zymomonas mobilis levans[J]．International Journal of Biological Macromolecules，2000，27：245-247.

[4]Vuong C，Kocianova S，Voyic6 J M，et al．A crucial mle for exopolysaccharide modification in bacterial biofilm formation，immune evasion，and virulence[J]．Journal of Biological Chemistry，2004，279：54881-54886.

[5]Rau U，Kuenz A，Wray V，et al．Production and structural analysis of the polysaccharide secreted by Trametes（Coriolus）versicolor ATCC 200801[J]．Applied Microbiology and Biotechnology，2009，81（5）：827-837.

[6]Zhao L Q，Chen Y L，Ren S，et al．Studies on the chemical structure and antitumor activity of an exopolysaccharide from Rhizobium sp．N613[J]．Carbohydrate Research，2010，345（5）：637-643.

[7]Asker M M S，Ahmed Y M，Ramadan M F．Chemical characteristics and antioxidant activity of exopolysaccharide fractions from Microbacterium terregens[J]．Carbohydrate Polymers，2009，77（3）：563-567.

[8]Gorska S，Jachyrnek W，Rybka J，et al．Structural and immunochemical studies of neutral exopolysaccharide produced by Lactobacillus johnsonii 142[J]．Carbohydrate Research，2010，345（1）：108-114.

[9]田文祥，蹇华丽，杨幼慧，等.产胞外多糖菌的鉴定及多糖性质研究[J].食品与机械，2012，28（1）：162-165.

[10]蹇华丽，田文祥，杨幼慧，等.多黏类芽孢杆菌PS04产胞外多糖发酵条件优化[J].食品科技，2013（1）：26-30.

[11]陈春英，丁玉强，Elmahadi E A，等.薯叶多糖的分离纯化及其理化性质的研究[J].中国生物化学与分子生物学报，1998，14（4）：422-431.

[12]王薇，黄海东，张禹，等．一种新型生物聚合物Ss的流变学性质及成胶特性[J]．微生物学通报，2008，35（6）：866-871.

[13]陈倩，李伟欣，程静，等．双歧杆菌22-5胞外多糖理化特性研究[J]．食品科学，2008，29（3）：364-368.

[14]陈雪峰，贾士儒，王岳，等．发菜多糖的红外光谱分析与抗氧化活性的研究[J]．分析与检测，2009，35（7）：133-137.

[15]张惟杰．糖复合物生化研究技术[M].杭州：浙江大学出版社，1999：242-243.

[16]Han Y W，Margaret A C.Production and characterization of microbial levan[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry，1990，38（2）：393-396.

[17]Liu J，Luo J G，Ye H，et al．Medium optimization and structural characterization of exopolysaccharides from endophytic bacterium Paenibacillus polymyxa EJS-3[J]．Carbohydrate Polymers，2010，79（1）：206-213.

[18]方积年．C-13NMR在多糖机构分析上的应用[J]．国外医药（抗生素分册），1982（2）：107-112，125.

[19]李波，陈海华，许时婴．二维核磁共振谱在多糖结构研究中的应用[J]．天然产物研究与开发，2005，17（4）：523-526.

Study on the molecular structure of polysaccharide produced by PS04 strain

JIAN Hua-li1，TIAN Wen-xiang2，YANG You-hui1，LIAO Mei-de3，*
（1.College of Food Science，South China Agricultural University，Guangzhou 510642，China；2.Guangdong Yifang Pharmaceutical Co.，Ltd.，Foshan 528244，China；3.College of Natural Resources and Environment，South China Agricultural University，Guangzhou 510642，China）

A single component peak was found in PS04 polysaccharide purity analysis using S-200 HR filtration of chromatography.The weight mean molecular weight of the PS04 polysaccharides examined by GPC was 4009ku，the peak positions molecular weight was 3174ku，and distribution width index was 1.348.The structure of PS04 polysaccharide was identified by infrared spectral，HPLC，and NMR.The results showed that PS04 polysaccharide was a typical polysaccharide compounds and the main composition was fructose and glucose （proportion 7∶1）.NMR analysis demonstrated that there were furan nucleus and the chain was linked by β-2，6 and β-1，2 linkage，so PS04 polysaccharide was similar to levan.

Paenibacillus polymyxa；exopolysaccharide；structural Identification

TS202.3

A

1002-0306（2014）08-0114-05

10.13386/j.issn1002-0306.2014.08.016

2013－08－16 *通讯联系人

蹇华丽（1977-），女，博士，副教授，研究方向：发酵工程。

广东省教育厅青年创新基金（2012LYM_0029）；华南农业大学校长基金（5100-K09151）；广州市科技计划项目（2008JI-c221）。